多重TaqMan熒光定量PCR檢測仔豬先天性震顫相關病毒方法的建立與應用

楊曉宇， 陳世界， 林 華， 張 婧， 安 微， 朱 玲,3

(1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130； 2.成都海關檢驗檢疫技術中心，四川 成都 610041； 3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

近年來，隨著中國生豬產業的快速發展，豬常見傳染性疾病由過去的單一感染逐漸轉變為混合感染，導致豬病的發病率和死亡率居高不下，給臨床檢測和防控帶來了困擾，嚴重影響了生豬產業的健康發展。仔豬先天性震顫(Congenital tremor，CT)俗稱“仔豬抖抖病”[1]，目前尚無有效治療措施，已經給養豬生產造成了巨大經濟損失。其病因可能包括營養因素、遺傳因素及病毒性感染因素等。目前，國內研究者已經多次報道，豬非典型瘟病毒(Atypical pestivirus，APPV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬圓環病毒3型(Porcine circoviruses type 3，PCV-3)和豬捷申病毒1型(Porcine teschovirus 1，PTV-1)是引起仔豬先天性震顫的主要病原[2-5]，這些病毒所致疾病在臨床上均表現出豬的頭部、四肢和尾部發生持續性震顫，有些患病仔豬呈“八”字腿，不能站立行走，對外界刺激較為敏感等。患病仔豬具有運動障礙、吮乳障礙等，最終因饑餓而很快衰竭致死。

目前尚無有效措施防控仔豬先天性震顫，及時確診是哪種病毒并加以輔助治療成為防治該病的關鍵。實驗室現有的大多數抗原檢測方法都是對某種病毒的單獨檢測，操作復雜，無法對引起仔豬先天性震顫的多種病毒進行同時檢測。本研究擬建立針對APPV、CSFV、PCV-3、PTV-1的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法，旨在高效、靈敏、特異性地對仔豬先天性震顫相關病毒進行區分鑒別，對于豬場防控仔豬先天性震顫相關病毒以及提高出生仔豬的成活率尤為重要，同時可為臨床樣本的快速篩檢及規模化豬場開展仔豬先天性震顫相關病毒流行病學調查提供快速、可靠的檢測方法，并可為仔豬先天性震顫相關病毒性流行病的科學防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒與病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬瘟病毒、豬非典型瘟病毒、豬圓環病毒3型、豬捷申病毒1型(PTV-1)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、豬輪狀病毒(Rotavirus，RV)均由四川農業大學動物生物技術中心提供并保存；血清采集于四川省各市的規模化養豬場。

1.2 主要試劑

50 bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司，PremixExTaq(Probe qPCR)、逆轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設計及合成

根據GenBank中已經登錄的病毒基因組信息，選取APPVNS3基因、CSFVE2基因、PCV-3ORF2基因和PTV-1VP1基因，用Prime Express 5.0軟件對上述基因的保守序列進行分析，再設計相應的特異性引物和探針。在APPV探針5′端標記FAM熒光基團，在3′端標記MGB基團；在CSFV探針5′端標記HEX熒光基團，在3′端標記BHQ1基團；在PCV-3探針5′端標記ROX熒光基團，在3′端標記BHQ2基團；在PTV-1探針5′端標記CY5熒光基團，在3′端標記BHQ2基團。APPV/CSFV/PCV-3/PTV-1引物探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，詳見表1。

表1 APPV/CSFV/PCV-3/PTV-1引物、探針序列

1.4 重組質粒標準品的制備

使用本試驗設計的引物，分別以APPV、CSFV、PCV-3、PTV-1的核酸序列為模板,50 μl反應體系包括25.0 μl 2×TaqPCR Master Mix、各2.5 μl上下游引物、5.0 μl模板、ddH2O。PCR反應程序如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，APPV 55 ℃ 30 s、PCV-3 55 ℃ 30 s、PTV-1 58 ℃ 30 s、CSFV 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 7 min。使用膠回收試劑盒對得到的陽性PCR產物進行純化、連接、轉化后，提取陽性質粒。將陽性克隆菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并對測序結果進行比對。結果表明，4種陽性重組質粒與試驗預期相符。將陽性標準品于-20 ℃保存，作為后續試驗的陽性模板。

1.5 多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

1.5.1 反應條件的優化 采用寶生物工程(大連)有限公司的PremixExTaq(Probe qPCR)試劑進行多重TaqMan熒光定量PCR檢測，分別以方法1.4中構建的APPV質粒、CSFV質粒、PCV-3質粒和PTV-1質粒為模板，在四者單獨優化的基礎上，使用矩陣法對40 μl反應體系的混合引物用量、探針用量及退火延伸溫度進行進一步優化，以篩選最適的反應體系和反應條件。

1.5.2 標準曲線的制作 取pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1等4種標準質粒，分別進行10倍梯度稀釋，同時設空白對照，每組3個平行重復。用優化后的多重TaqMan熒光定量PCR體系及擴增程序進行檢測，最后建立標準曲線。

1.5.3 特異性試驗 用本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3、RV、PRRSV、JEV、PRV進行特異性試驗，以評價該方法的特異性。

1.5.4 靈敏性試驗 分別將pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1等4種重組質粒按10倍梯度稀釋，再分別選取1 μl 105～100拷貝的重組質粒作為模板，用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR和常規PCR方法進行檢測，確定檢測下限并對2種方法的靈敏性進行分析、評價。

1.5.5 重復性試驗 在相同條件下，使用已建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法進行3次獨立的組內、組間重復性試驗，用變異系數(CV)來評價方法的重復性。

1.6 臨床樣品檢測

采集來自四川省部分地區規模化豬場的全身震顫的疑似患病仔豬樣品(組織器官、血清、精液)273份，用本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法進行檢測，分析相關病毒的共感染情況。

2 結果與分析

2.1 多重TaqMan熒光定量PCR方法的建立

將設計并合成好的4對引物和探針分別稀釋至10 μmol/L的工作濃度，使用矩陣法調節引物用量(0.5 μl、1.0 μl、1.5 μl)、探針用量(0.10 μl、0.25 μl、0.50 μl、1.00 μl)和退火溫度(52.0 ℃、52.7 ℃、54.0 ℃、55.9 ℃、58.4 ℃、60.3 ℃、61.4 ℃和 62.0 ℃)對四重熒光逆轉錄(RT) PCR反應條件進行優化。最終確定的40.00 μl四重熒光RT-PCR反應體系如下：20 μl PremixExTaq(Probe qPCR)，各1.00 μl 4對上、下游引物，CSFV、PTV-1、PCV-3、APPV探針用量分別為0.50 μl、0.50 μl、0.25 μl、0.25 μl，各1.00 μl 4種標準質粒模板，其余用去離子水補足。得出四重熒光RT-PCR的最佳反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s，40 個循環，退火階段收集熒光信號。

2.2 標準曲線的繪制

1：pMD-CSFV(豬瘟病毒質粒)，2：pMD-PCV-3(豬圓環病毒3型質粒)，3：pMD-PTV-1(豬捷申病毒1型質粒)，4：pMD-APPV(豬非典型瘟病毒質粒)。Cq表示在PCR擴增過程中，樣品擴增熒光信號達到設定閾值時所經歷的擴增循環數。圖1 多重TaqMan熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curve of multiple TaqMan fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性

應用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對 APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3、RV、PRRSV、JEV、PRV的基因組進行檢測，結果顯示，僅APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3出現典型的擴增曲線，而其他病毒的基因組均未出現擴增曲線(圖2)，表明該方法具有良好的特異性。

1：PCV-3(豬圓環病毒3型)；2：CSFV(豬瘟病毒)；3：APPV(豬非典型瘟病毒)；4：PTV-1(豬捷申病毒1型)；5：RV(豬輪狀病毒)；6：PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)；7：JEV(豬乙型腦炎病毒)；8：PRV(偽狂犬病毒)。圖2 特異性試驗結果Fig.2 Results of the specificity assay

2.4 靈敏性

采用本研究已經建立的檢測方法對質粒含量為1 μl 100～105拷貝的陽性模板進行PCR擴增。如圖3、圖4所示，多重TaqMan熒光定量PCR方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限依次為1 μl 48拷貝、9.2×102拷貝、17拷貝、56拷貝；常規PCR方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限依次為1 μl 4.8×103拷貝、9.2×104拷貝、1.7×103拷貝、5.6×104拷貝。對結果進行分析發現，在對APPV、CSFV和PTV-1的檢測中，多重TaqMan熒光定量PCR的最低檢測限相較于常規PCR提高了100倍，而對PCV-3的最低檢測限相較于常規PCR更是提高了1 000倍，表明本研究所建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法比常規PCR方法更加靈敏。

A：PCV-3(豬圓環病毒3型)；B：PTV-1(豬捷申病毒1型)；C：CSFV(豬瘟病毒)；D：APPV(豬非典型瘟病毒)；1～5：1 μl 105～101拷貝標準模板的多重TaqMan熒光定量PCR擴增曲線。圖3 多重TaqMan熒光定量PCR靈敏性試驗結果Fig.3 Results of sensitivity test by multiple TaqMan fluorescence quantitative PCR

A：PCV-3(豬圓環病毒3型)；B：PTV-1(豬捷申病毒1型)；C：CSFV(豬瘟病毒)；D：APPV(豬非典型瘟病毒)；1～6：1 μl 105～100拷貝標準模板的常規PCR擴增結果。圖4 常規PCR靈敏性試驗結果Fig.4 Results of sensitivity test by common PCR

2.5 重復性

分別選取5個含量的pMD-APPV、pMD-CSFV、pMD-PCV-3和pMD-PTV-1標準質粒為模板，進行組內和組間重復試驗。表2結果顯示，APPV、CSFV的組內重復試驗變異系數均小于1.50%；PCV-3、PTV-1的組內重復試驗變異系數均小于2.10%；APPV、CSFV的組間重復試驗變異系數均小于1.00%；PCV-3、PTV-1的組間重復試驗變異系數均小于1.60%。

2.6 臨床樣品檢測

應用本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR方法對采集的疑似患病仔豬的組織器官、血清、精液等臨床樣品進行檢測。結果顯示，APPV的檢出率為20.5%(56/273)，CSFV的檢出率為2.9%(8/273)，PCV-3的檢出率為10.6%(29/273)，PTV-1的檢出率為1.5%(4/273)。其中APPV、CSFV二者共同感染的檢出率為1.5%(4/273)，APPV、PCV-3二者共同感染的檢出率為4.4%(12/273)，APPV、PTV-1二者共同感染的檢出率為1.5%(4/273)，APPV、CSFV、PCV-3共同感染的檢出率為1.1%(3/273)。臨床檢測結果顯示，APPV和PCV-3的單獨感染尤為嚴重，混合感染類型復雜，給相關疾病的防控帶來困難，因此建立高效、靈敏的多重檢測方法尤為重要。

3 討 論

本試驗建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法對CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限分別為1 μl 48拷貝、9.2×102拷貝、17拷貝、56拷貝，常規PCR方法檢測CSFV、APPV、PTV-1、PCV-3的最低檢測限分別為1 μl 4.8×103拷貝、9.2×104拷貝、1.7×103拷貝、5.6×104拷貝，其中APPV、CSFV、PTV-1的最低檢測限均比常規PCR方法提高了100倍，PCV-3的最低檢測限比常規PCR方法提高了1 000倍。本試驗對采集樣品進行檢測的結果顯示，APPV、CSFV、PTV-1、PCV-3的檢測陽性率分別為20.5%、2.9%、1.5%、10.6%，其中APPV、CSFV共同感染的檢出率為1.5%，APPV、PCV-3共同感染的檢出率為4.4%，APPV、PTV-1共同感染的檢出率為1.5%，APPV、CSFV、PCV-3共同感染的檢出率為1.1%。本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法具有良好的靈敏性、特異性和重復性。

表2 重復性試驗結果

自從1962年趙文遠等[6]在中國首次發現仔豬先天性震顫以來，國內外的獸醫工作者進行了長時間的研究，但一直無法找到發病的原因。1998年陸文俊等[7]、2005年羅建等[2]分別使用動物接種試驗和免疫熒光染色等方法發現仔豬先天性震顫病例的豬場中存在豬瘟病毒。2005年Hause等[3]研究證實，APPV可能是仔豬先天性震顫的病原。 隨后，全球多個國家先后在農場中檢測并發現豬群中有APPV的流行[8-11]。2016-2017年，Chen等[4]使用熒光定量PCR方法對中國廣西、廣東2省患仔豬先天性震顫的豬群進行長時間監測，結果發現，仔豬先天性震顫與PCV-3感染可能存在聯系，受仔豬先天性震顫影響仔豬的PCV-3組織嗜性分析結果顯示，PCV-3主要侵害患病動物的腦、心臟，兩者的病毒載量較高。2018年，Possatti等[5]使用巢式PCR方法首次發現APPV與PTV混合感染，共同影響新生仔豬，并且二者起到協同作用。仔豬先天性震顫的發病率為1.8%～35.0%，在沒有喝初乳的條件下，患病仔豬的死亡率達到100.0%。由于尚無有效的治療措施，因而及時確定病原并加以輔助治療成為防治該病的關鍵。目前大多數檢測方法都為單重檢測，操作復雜，無法對仔豬先天性震顫相關病毒進行同時檢測。本研究建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測方法，可以高效、靈敏、特異地對仔豬先天性震顫相關病毒進行區分、鑒別，對于豬場防控仔豬先天性震顫以及提高出生仔豬的成活率尤為重要。基于該方法對四川地區仔豬先天性震顫相關病毒共感染情況進行流行病學調查，可以為該病的防治提供重要的數據基礎。

4 結 論

本研究成功建立了靈敏性高、特異性強、耗時短的檢測仔豬先天性震顫相關病毒的多重TaqMan熒光定量PCR方法，實現了對仔豬先天性震顫相關病毒的快速、準確鑒別與診斷。