當歸補血湯發酵產物對肉雞免疫和抗氧化能力的影響

陳柯源， 宋向東， 程 峰， 張玉珺， 梁劍平， 郝寶成

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業農村部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室, 甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730050)

隨著畜禽養殖業規模的逐漸擴大，減抗(減少使用抗生素)、限抗(限制使用抗生素)的呼聲日益高漲，中藥飼料添加劑將是畜禽養殖業未來發展的選擇。中藥具有抗菌、增強免疫等多種生物活性，作為畜禽飼料添加劑已被廣泛使用。當歸補血湯(Danggui buxue tang，DBT)是一種傳統的中藥復方，由黃芪和當歸組成，干質量比例為1∶5[1]，藥理學研究結果表明，當歸補血湯具有促進造血功能，刺激心血管循環，增加抗氧化及免疫活性的能力[1-8]。然而與中藥相比，益生菌發酵中藥具有毒副作用小、無抗藥性、功能多樣等優點，對動物機體有著更為顯著的積極作用。多項研究結果表明，發酵中藥可顯著提高肉雞日增質量，降低料肉比并對機體相關免疫指標起到明顯的積極調控作用[9-11]。因此，研究和開發新型的綠色、無公害飼料添加劑已成當前的必然發展趨勢。DBT作為經典中藥復方，雖然在前期研究中發現其具有一定的促生長和提高免疫功能等作用，但效果并不顯著，不能完全發揮DBT中藥復方中有效成分的活性作用，且缺乏發酵DBT對肉雞生長性能、免疫功能及抗氧化能力影響的系統研究。本研究擬采用枯草芽孢桿菌液體發酵DBT的方式制備DBT發酵產物，通過42 d的飼喂試驗和相關指標測定，深入探討并系統研究DBT發酵產物對肉雞生產性能、免疫功能、抗氧化能力及十二指腸絨毛形態的影響，為DBT發酵產物用作新型飼料添加劑提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；新城疫(Lasota株)、傳染性法氏囊疫苗購自哈藥集團有限公司。黃芪、當歸均購自甘肅復興厚生物醫藥科技有限公司；雞IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α等試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司(生產批號：SBE221910)；血清GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(生產批號：20190526)。

1.2 DBT藥粉及發酵產物的制備

DBT藥粉制備：將黃芪和當歸洗凈烘干后，按5∶1的質量比準確稱取2種藥材混合粉碎，并過60目篩。DBT發酵產物制備：無菌條件下，取-70 ℃下保存的枯草芽孢桿菌接種于血平板上，于37 ℃恒溫箱中過夜培養。挑取單菌落于5 ml LB肉湯中，在37 ℃，160 r/min條件下培養15 h，以2%的體積分數接種于100 ml LB肉湯中，相同條件下傳代培養得到種子液。以2.92%的體積分數將種子液接種于發酵培養基(0.95%無水葡萄糖，1.52%蛋白胨，0.30%酵母浸出粉，0.05%磷酸氫二鉀，0.07%無水硫酸鎂，0.02%碳酸鈣，6.00% DBT藥粉，100 ml去離子水，初始pH為7.2)中，在37 ℃，160 r/min條件下培養35.8 h，冷凍干燥后得到DBT發酵產物，發酵產物中枯草芽孢桿菌活菌數約為6.8×108CFU/g)。

1.3 試驗動物與日糧

試驗動物為210只1日齡體質量相近、健康的白羽肉雞，隨機分成5個處理，每個處理6個重復，每個重復7只雞，A1為對照組，飼喂基礎日糧，A2為DBT未發酵組，在基礎日糧中添加1.0%的DBT藥粉, A3、A4、A5為DBT發酵組，在日糧中分別添加0.5%、1.0%、2.0%的DBT發酵產物。試驗期為42 d，1～21 d為試驗前期，22～42 d為試驗后期。

試驗飼糧采用玉米-豆粕型基礎飼糧，根據中國雞飼養標準(2004)營養需要量進行飼糧配制，組成及營養水平見表 1。每個平養籠中飼養7只肉雞，試驗期間所有肉雞飼養管理條件一致，環境溫度從36 ℃逐漸降至22 ℃，自由采食和飲水，24 h光照，并按常規免疫程序進行疫苗接種。

表1 基礎飼糧組成和營養水平(風干基礎)

1.4 測定指標和方法

1.4.1 生長性能測定 分別在肉雞21日齡和42日齡，禁食12 h，對每個重復的供試肉雞稱質量，并詳細記錄各個階段的飼料消耗量，計算2個階段肉雞的平均日增質量(ADG)、平均日采食量(ADFI)以及料肉比(F/G)。

1.4.2 樣品采集 分別在肉雞21日齡和42日齡，禁食12 h，從每個重復的供試肉雞中隨機抽取2只，心臟采血10 ml，于4 ℃過夜，然后3 000 r/min離心10 min，分離血清于-80 ℃中保存，待測。

1.4.3 免疫器官臟器指數測定 分別在肉雞21日齡和42日齡，心臟采血后放血處死，剖檢，采集脾臟、法氏囊并稱質量，臟器指數=臟器濕質量/體質量×100%

1.4.4 十二指腸絨毛形態觀察 分別在肉雞21日齡和42日齡，心臟采血后放血處死，剖檢，在十二指腸的中間部位截取約2～3 cm，迅速浸入生理鹽水中漂洗內容物，然后置于10%甲醛固定液中，將固定的標本經水洗、脫水、透明等步驟處理，再用石蠟包埋，冷卻凝固后，制作厚度5 μm的切片，蘇木精伊紅染色，樹脂封片。在石蠟切片中選出典型視野，采用生物顯微鏡及顯微圖像分析系統，測量腸絨毛高度(V)和隱窩深度(C)，并計算絨毛高度與隱窩深度比(V/C)。

1.4.5 新城疫抗體效價測定 用新城疫疫苗在7 d和21 d時對各組肉雞進行點眼滴鼻免疫接種，采用半微量血凝抑制實驗法測定HI抗體效價。

1.4.6 細胞因子測定 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清白細胞介素2 (IL-2)、白細胞介素6 (IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素(INF-γ)含量，詳細步驟參考試劑盒說明書。

1.4.7 抗氧化指標的測定 參照試劑盒說明書中的步驟進行血清中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量測定。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS23. 0軟件進行單因素(One-way ANOVA)方差分析，并采用LSD法進行組間差異顯著性檢驗，以P<0.05作為差異顯著水平，數據分析結果用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 DBT發酵產物對肉雞生產性能的影響

由表2可知，在生長前期和整個試驗期(1～21 d和1～42 d)中，各試驗組肉雞(A2～A5)的日增質量與對照組相比無顯著差異，但A4和A5處理的日采食量與A2處理和對照組相比顯著減少(P<0.05)，并且從整個試驗期來看，DBT發酵組的料肉比顯著低于A2處理和對照組(P<0.05)。而在試驗后期(22～42 d)，各試驗組(A2～A5)肉雞日增質量均有顯著提高(P<0.05)，其中，A4和A5處理最為顯著(P<0.05)，但兩組之間無顯著差異，同時，試驗組A2～A5的日采食量、料肉比與對照組相比均顯著減少(P<0.05)，其中，A4和A5處理的料肉比與A2處理相比顯著降低(P<0.05)，各試驗組之間日采食量差異不顯著。

表2 DBT發酵產物對肉雞生長性能的影響

2.2 DBT發酵產物對肉雞免疫器官指數的影響

由表3可知，在21 d時，A4處理與A2相比脾臟指數顯著增加 (P<0.05)，其他各組之間差異不顯著。A3～A5處理的法氏囊指數與對照組和A2處理相比具有顯著差異(P<0.05)，A2處理與對照組差異不顯著。

在42 d時，A3～A5處理的脾臟指數與對照組和A2處理相比具有顯著差異(P<0.05)，A3～A5處理之間以及對照組與A2處理之間差異不顯著(P>0.05)。A4和A5處理的法氏囊指數與其他3組相比均顯著增加(P<0.05)，但A4處理與A5處理間無顯著差異，A3處理和A2處理與對照組相比差異也不顯著。

表3 DBT發酵產物對肉雞免疫器官指數的影響

2.3 DBT發酵產物對肉雞血清新城疫抗體效價的影響

由圖1可知，在21 d和42 d，A4和A5處理的抗體效價均比其他3組有顯著提高(P<0.05)，且A5處理高于A4。A2處理與A3處理與對照組相比較在21 d時均有一定水平提高(P<0.05)，但在42 d時差異不顯著。

2.4 DBT發酵產物對肉雞血清細胞因子的影響

由圖2可知，在21 d和42 d時，與A2處理和對照組相比，DBT發酵組對于肉雞血清中各個細胞因子的影響具有顯著差異，其中， A4處理和A5處理影響較為突出(P<0.05)，但處理之間差異不顯著。從整體上看，A4處理可顯著影響血清中4種細胞因子含量，與對照組相比，在21 d時，A4和A5處理可使血清中IL-2(圖2A)、IL-6(圖2B)、TNF-α(圖2C)、INF-γ(圖2D)含量得到顯著提高(P<0.05)。A2處理與對照組相比，IL-2含量顯著增加(P<0.05)，其他3個指標均無顯著差異。在42 d時，與對照組相比，A4處理血清中IL-2、IL-6含量顯著降低(P<0.05)，而TNF-α、INF-γ含量則顯著提高(P<0.05)。與對照組相比，A2處理在IL-2、IL-6含量上差異不顯著，但在TNF-α、INF-γ含量上顯著提高(P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時間處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 DBT發酵產物對肉雞血清新城疫抗體效價的影響Fig.1 Effects of DBT fermentation products on ND-HI immune globulin of serum in broilers

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時間處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 DBT發酵產物對肉雞血清細胞因子的影響Fig.2 Effects of DBT fermentation products on cytokine of serum in broilers

2.5 DBT發酵產物對肉雞血清抗氧化指標的影響

由圖3可知，在21 d時，各組之間的超氧化物歧化酶及總抗氧化能力無顯著性差異(P>0.05)，與對照組相比， A3、A4、A5處理谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均顯著提高(P<0.05)，但各試驗組之間差異不顯著(P>0.05)。A4處理和A5處理與其他3組相比較，血清中丙二醛含量顯著降低(P<0.05)，但A4、A5處理之間以及其他3組之間差異不顯著。在42 d時，與A2處理和對照組相比，A4處理和A5處理肉雞血清中各抗氧化指標差異顯著(P<0.05)，但A4處理和A5處理之間差異不顯著。

2.6 DBT發酵產物對肉雞十二指腸絨毛形態的影響

由表4可知，在21 d，與對照組和A2處理相比較，A4處理和A5處理的肉雞十二指腸絨毛高度有所增加，且隱窩深度相對降低，同時，絨毛高度與隱窩深度比值增加，此外，A4處理和A5處理與對照組相比，各指標也表現出相同的變化趨勢，但各組之間無顯著差異(P>0.05)。

在42 d，各試驗組與對照組相比，絨毛高度都有所增加，且DBT發酵組高于DBT未發酵組，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。各試驗組的隱窩深度與對照組相比都有所減少，A4處理的絨毛高度與隱窩深度比值與對照組和A2處理相比均顯著提高 (P<0.05)。

A1、A2、A3、A4、A5見表2注；不同小寫字母表示同一時間處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 DBT發酵產物對肉雞血清抗氧化能力的影響Fig.3 Effects of DBT fermentation products on serum antioxidant capacity of broilers

表4 DBT發酵產物對肉雞十二指腸絨毛形態的影響

3 討 論

本研究結果顯示，日糧基礎飼料中添加1.0%的DBT發酵產物(A4處理)可有助于提高肉雞的日增質量，降低料肉比和日采食量，并顯著改善動物的免疫功能和抗氧化能力，同時對十二指腸絨毛形態的完整性也起到了保護作用，且效果優于DBT未發酵組。

益生菌發酵中藥技術極大促進了畜牧養殖業的健康發展。傳統中藥可顯著提高肉雞的生長性能[12]，而發酵中藥使中藥藥效在動物體內得到了更好的發揮。相關研究報道顯示，張曉靜等通過在日糧中添加發酵黃芪-甘草水提物或黃芪發酵產物，可使肉雞的日增質量和料肉比都分別顯著升高和降低，且發酵中藥的效果優于未發酵中藥[13-14]。本研究結果表明，發酵DBT可顯著增加肉雞日增質量，減少日采食量并降低料肉比，同時DBT發酵組的作用效果要優于DBT未發酵組，這與上述研究報道一致。這可能是由于中藥發酵后有效成分含量增加，從而藥效增強。同時，本試驗中所采用的枯草芽孢桿菌是農業農村部允許作為飼料添加劑的益生菌菌種之一，其廣譜的抗菌活性以及平衡腸道菌群的作用，可顯著提高動物的生產性能[15-16]。因此，DBT發酵產物對肉雞的生長有顯著的促進作用。

良好的免疫性能可平衡體內免疫相關活性物質的分泌，從而有效抵抗外界致病菌。IL-2和IL-6可分別通過細胞和體液免疫的調節來促進免疫球蛋白和抗體的產生[17-19]。IFN-γ可通過激活巨噬細胞達到促進對病原體的吞噬及殺傷的作用，同時還可誘導B細胞分化，促進抗體的產生。TNF-α可對相關細胞因子的分泌和單核巨噬細胞的活化起到調控作用，進而發揮抗病毒功效[20-21]。相關研究發現，肉雞經飼喂中藥發酵產物后，其脾臟、法氏囊指數、ND抗體效價以及血清中IgG和IL-2含量等免疫性能指標與未發酵組相比均有顯著提高[22-23]。作為禽類最重要的免疫器官，脾臟和法氏囊對體內免疫活性物質的產生起著重要作用。本研究中，1.0% DBT發酵組與DBT未發酵組和對照組相比，ND抗體效價、各細胞因子水平及免疫器官指數在21 d時均顯著增加。這可能與發酵產物中多糖含量的增加有關[24]，因為多糖具有抗腫瘤和刺激機體免疫等功能，使免疫指標水平得到顯著提高，此外，IL-2和IL-6作為促炎因子，若長期在體內維持高水平表達，則會導致相關免疫細胞消耗大量物質和能量來平衡免疫應答[25]。本研究結果顯示，在42 d時，DBT發酵組IL-2和IL-6的含量與其他組相比明顯下降，而其他免疫指標則顯著升高，說明1.0%的DBT發酵產物對肉雞免疫性能具有良好的調節作用。

T-AOC、MDA、GSH-Px和SOD是評價機體抗氧化能力的重要指標[26]。T-AOC可反映機體對外界刺激的代償能力和機體自由基代謝狀態，MDA含量與細胞的氧化損傷程度有關[27-28]，GSH-Px和SOD可分別清除細胞代謝過程中產生的多余脂質過氧化物和超氧陰離子自由基，從而使細胞的形態結構保持正常水平。多項研究報道顯示，發酵中藥可對肉雞抗氧化性能起到顯著的改善作用，安勝英等[29]發現0.5%的中藥復方發酵產物可使仔雞血漿中GSH-Px的活性顯著升高，同時明顯降低了腿肌MDA含量。此外，給肉雞飼喂1%的補中益氣湯發酵制劑也可使其血清和肝臟中的T-SOD、GSH-Px活性等抗氧化指標得到顯著改善，且功效優于未發酵組[30]。本研究結果顯示，1.0%的DBT發酵產物可顯著增加肉雞血清中T-AOC能力和GSH-Px、SOD活性，同時使血清MDA含量明顯下降，這與上述研究報道相一致。DBT中含有黃芪多糖、黃芪甲苷、阿魏酸等多種抗氧化成分，但在本試驗中，DBT未發酵組對肉雞的抗氧化指標并未起到十分顯著的影響，推測可能由于本試驗肉雞品種對DBT藥物敏感度較低所致，而DBT與枯草芽孢桿菌互作后，菌種的次級代謝產物可能與DBT的活性成分發生生物轉化，合成新的抗氧化成分，從而對肉雞的抗氧化性能的提高起到促進作用。

小腸絨毛形態間接反映了機體的生長發育狀況，小腸絨毛高度和隱窩深度是評價動物消化吸收能力的重要指標，腸絨毛V/C值的高低與腸道凈吸收量呈正相關[31-32]。前人研究報道指出，發酵芪楂口服液藥渣使仔豬空腸、回腸絨毛高度和V/C值明顯大于未發酵組，且絨毛寬度和隱窩深度小于未發酵組[33]，這說明發酵中藥對小腸絨毛形態有良好的改善作用。此外，益生菌對于維持腸絨毛形態的完整性也有顯著影響。有研究報道，枯草芽孢桿菌E-8可對大腸桿菌性腹瀉有顯著的治療效果，并對肉雞小腸絨毛形態起到良好的修復作用[34]。本試驗采用枯草芽孢桿菌作為發酵菌種得到DBT發酵產物，與對照組和未發酵組相比，1.0% DBT發酵組可對小腸絨毛形態起到明顯的改善作用，與上述研究報道相一致。

本研究中所用DBT經益生菌發酵后，DBT的有效活性成分種類及含量可能發生了某些改變，鑒于本次試驗條件的局限性，僅對中藥發酵產物的使用效果進行了研究，其作用機制尚需進一步研究。