甘藍型油菜脂肪酸脫氫酶2兔源多克隆抗體的制備與應用

熊 丹， 周 霆， 田方艷， 饒力群， 陳 松， 汪啟明

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128； 2.湖南遠泰生物技術有限公司，湖南 長沙 410000； 3.江蘇省農業科學院經濟作物研究所/農業部長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

油脂是人體必需的關鍵營養素之一，是維持身體機能正常運轉的能量來源，更是細胞、組織、臟器的重要組成成分。油菜是僅次于大豆和花生的第三大植物油脂來源[1]，菜籽油含有豐富的油酸、亞油酸、亞麻酸以及維生素E等有效成分，亞油酸、亞麻酸是人自身無法合成的必需脂肪酸，百分之九十九能被人體所吸收[2-3]。適量的補充亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，可軟化血管，預防心血管疾病的發生[4]，但是亞油酸和亞麻酸相較于油酸，更容易氧化發生酸敗，產生不利于健康的物質[5-6]。如何合理控制各脂肪酸比例構成，提高菜籽油品質，已成為油菜品種改良的重要研究方向。

前期對甘藍型油菜高油酸品種的基因分析結果表明，其高油酸性狀的產生是由于FAD2基因突變導致[7-10]。FAD2基因編碼的是一種脂肪酸脫氫酶2(FAD2)，該蛋白質定位于內質網上，催化油酸轉化為亞油酸[11-13]。亞油酸又可被脂肪酸脫氫酶3轉化為亞麻酸[14]。所以，FAD2是控制油菜高油酸產量，保持脂肪酸穩定性的關鍵基因，多個油菜品質改良項目曾圍繞此基因進行[15-17]。

目前，對于FAD2基因功能改變的檢測，主要還是以FAD2酶催化的底物和產物含量的變化為主。即通過氣相[18]、液相[19]以及紅外光譜[20-21]等手段，檢測樣本中油酸和亞油酸或亞麻酸含量的變化，從而監測此基因功能是否改變。在利用免疫學方法對蛋白質積累檢測方面，由于暫未有商業化的可用于植物FAD2蛋白檢測的特異性抗體及其相關制備報道，在前期研究中，主要是用基因工程方法融合其他標簽，通過使用標簽抗體對融合標簽進行檢測[13,22]來體現FAD2蛋白表達變化，并不能完全體現內源性FAD2蛋白表達的變化。本研究對甘藍型油菜FAD2蛋白進行生物信息學分析，通過合成特征性多肽片段免疫動物，獲得特異性針對甘藍型油菜FAD2蛋白的兔源多克隆抗體，為該蛋白質翻譯后調控機制的研究提供有利工具。可以用此抗體識別不同品種油菜不同栽培條件下FAD2蛋白表達差異，為后期育種篩選及栽培條件優化以及轉基因安全評價方法的簡化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要植物材料

甘藍型油菜品種(Westar)WT和FAD2-RNAi高油酸轉基因油菜品系W-4由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供。

1.2 試驗動物

本研究選用的動物為2只雄性新西蘭大白兔，購于湖南太平生物科技有限公司。在湖南遠泰生物技術有限公司清潔級動物飼養房中飼養，室溫維持22 ℃，正常的晝夜頻率，一兔一籠。提供充足的飼料和干凈的飲用水，試驗動物可以自由進食和飲水，維持體質量在2.5～3.5 kg。該動物試驗方案得到了湖南遠泰生物技術公司動物倫理委員會的批準(依據《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》)。

1.3 主要試劑

HRP labeled anti-IgG、anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody由Promab提供，anti-actin Mouse monoclonal antibody購于CWbio公司，anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody、ECL試劑盒購于CST公司，弗氏完全佐劑以及弗氏不完全佐劑購于Sigma公司，Protein A Sepharose購于GE公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于北京鼎國公司，蛋白質marker購于Thermo Fisher公司，BCA蛋白檢測試劑盒購于BioSharp公司。

研磨緩沖液(0.240 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.060 mol/L KCl, 0.250 mol/L蔗糖, 0.024 mol/L MgCl2)，內質網分離緩沖液(0.040 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.010 mol/L KCl, 0.040 mol/L MgCl2, 0.005 mol/L EDTA)，儲存于4 ℃條件下，使用前加入0.006 mol/L DTT, 0.006 mol/L PMSF。

1.4 抗原確定與合成

在UniProtKB數據庫中搜索關鍵詞：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息。

采用ABCpred Prediction Server在線軟件[23]分析BnFAD2(UniProtKB：C3W518)氨基酸B細胞抗原表位，將預測表位陣列得分超過0.9的序列，輸入NCBI數據庫中，與油菜蛋白質庫進行氨基酸序列比對，驗證氨基酸表位序列的特異性。選取得分以及特異性最高的2條多肽序列(PA和PB)，于杭州中肽生化有限公司進行多肽合成，并將合成好的多肽分別偶聯到KLH和BSA上。

1.5 BnFAD2兔源多克隆抗體的制備

1.5.1 動物免疫 初次免疫前，兔耳靜脈采血作為免疫陰性對照血清。BnFAD2-PA-KLH多肽與BnFAD2-PB-KLH多肽凍干粉溶解后，各取50 mg混合均勻，再與等體積弗氏完全佐劑按比例混合，多點皮下注射新西蘭大白兔。21 d后，混合抗原量減半與弗氏不完全佐劑混合，進行第二次免疫。以此方式每隔14 d，進行第三以及第四次免疫。4次免疫后7 d，兔耳靜脈采血，常溫下3 000 r/min離心20 min，取血清，用于后續檢測。

1.5.2 免疫酶聯法檢測免疫血清 酶標板中抗原BnFAD2-PA-BSA以及BnFAD2-PB-BSA的包被量為每孔0.2 μg。以免疫前血清為陰性對照，以1∶5 000稀釋HRP labeled anti-IgG作為二抗，檢測不同稀釋度的免疫兔血清，TMB顯色終止后，在酶標儀上讀取吸光度值(OD450)。

1.5.3 BnFAD2兔源多克隆抗體的純化 收集全兔血，離心分離血清。按照說明書所述方法，將血清進行Protein A Sepharose親和層析純化，獲得BnFAD2兔源多克隆抗體。用SDS-PAGE凝膠法鑒定該兔多抗的蛋白質分子量大小與純度，BCA法鑒定其濃度。

1.6 甘藍型油菜品種W-4不同世代FAD2蛋白表達的鑒定

1.6.1 油菜樣本總蛋白質的提取 取一定體積的樣品(WT、W-4的T3代,W-4的T7代植株開花21 d后的果莢以及成熟期葉片)，液氮研磨成粉末狀后，參照文獻[24]、[25]，研磨緩沖液勻漿,經2次2 000g離心5 min后，取2 ml上清液樣品留樣，其余上清液加入到含有5 ml 50%蔗糖溶液的超離心管中，100 000g離心20 min，收集總膜層(50%蔗糖溶液與勻漿上清液之間)，等體積混合內質網分離緩沖液，采用蔗糖梯度(7 ml 15% 蔗糖溶液，12 ml 35% 蔗糖溶液和5 ml 40% 蔗糖溶液)100 000g離心30 min，收集粗面內質網膜組分(35% 蔗糖與40% 蔗糖溶液之間)，加入3倍體積內質網分離緩沖液，100 000g離心30 min，沉淀用少量預冷的內質網分離緩沖液重懸，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。所有離心均在4 ℃進行。

1.6.2 SDS-PAGE分離蛋白質 根據SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司產品)說明書配制分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%的SDS-PAGE凝膠。將樣本分果莢總蛋白質、葉片總蛋白質、內質網蛋白質3個組別，每個組別經BCA法進行蛋白質定量后，統一上樣量，用Mini-PROTEAN? Tetra(Bio-Rad)系統進行凝膠電泳。

1.6.3 Western Blotting法鑒定甘藍型油菜同世代 FAD2蛋白表達 樣品通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉至NC膜上。經5%的脫脂奶封閉1 h，一抗(anti-BnFAD2 Rabbit Polyclonal antibody，稀釋比為1∶1 000，anti-actin Mouse monoclonal antibody，稀釋比為1∶2 500)孵育過夜，用PBST緩沖溶液進行洗膜后加入對應的二抗(anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody,稀釋比為1∶30 000，anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody，稀釋比為1∶10 000)，室溫孵育2 h，洗膜后，使用ECL試劑盒進行顯影。

2 結果與分析

2.1 油菜FAD2抗原表位預測和鑒定

在UniProtKB數據庫中搜索關鍵詞：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息，其UniProtKB序列號為C3W518，定位在內質網上(圖1A)，是由384個氨基酸組成的4次跨膜結構蛋白質(如圖1B所示)。ABCpred在線系統對該氨基酸序列進行B細胞表面抗原表位預測，肽的較高得分意味著有較高的概率作為表位。方框中氨基酸部分為此抗原表位預測分數超過0.9的區域(圖1 C)。參考預測結果和蛋白質細胞亞定位的特點，我們選擇位于細胞質結構中并且預測分數較高的區域，在NCBI數據庫中對油菜蛋白質氨基酸序列進行比對，最后選擇PA:VSPPSKKSETDTIKR(9～23 aa)以及PB:SHRRHHSNTGSLERD(140～154 aa)2條多肽為免疫抗原表位(命名及區域氨基酸序列如圖1 B下劃線部分所示)。

A:BnFAD2蛋白的亞細胞定位(圖片來源于UniProtKB數據庫);B:BnFAD2蛋白跨膜結構簡圖與抗原肽段選擇位點;C:ABCpred在線系統對BnFAD2 B細胞表面抗原表位的預測結果。劃橫線的表示合成多肽的氨基酸序列；方框里表示抗原表位預測分數超過0.9的區域。圖1 BnFAD2抗原表位預測Fig.1 Epitopes prediction of BnFAD2

用質譜法(Mass spectrum, MS)進行多肽鑒定。結果如圖2顯示，BnFAD2-PA的相對分子質量為1 776，BnFAD2-PB的相對分子質量為1 892，2條多肽測定的相對分子質量與理論值相符。

圖2 BnFAD2多肽質譜鑒定結果Fig.2 Identification of BnFAD2 polypeptide by mass spectrometry

用高效液相法(High performance liquid chromatography, HPLC)對2條合成的多肽進行純度分析(圖3)，BnFAD2-PA的純度為80.19%，BnFAD2-PB的純度為96.24%(表1)。

圖3 BnFAD2多肽的高效液相分析結果Fig.3 Identification of BnFAD2 polypeptide by high performance liquid chromatography

表1 BnFAD2-PA以及BnFAD2-PB純度分析

2.2 BnFAD2兔源多克隆抗體的獲得

將第四次免疫后第7 d采集的兔血清進行ELISA試驗，鑒定免疫效果。如圖4所示，1號兔和2號兔免疫抗原后，對BnFAD2-PA與BnFAD2-PB多肽都產生了免疫反應。1號兔免疫反應高于2號兔。

取全血進行Protein A Sepharose親和層析，所得到的蛋白質溶液10倍稀釋后進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，如圖5所示，在非變性條件下，該抗體在大于150 000處有條帶，與完整抗體分子條帶相符，變性條件下，在50 000以及25 000左右有兩條帶，即抗體重鏈和輕鏈。此蛋白質大小與抗體大小相符，抗體結構完整。BCA法定量得到稀釋后該抗體質量濃度為0.57 mg/ml，獲得的抗體總產品質量濃度為5.7 mg/ml。

A:包被抗原為BnFAD2-PA-BSA;B:包被抗原為BnFAD2-PB-BSA。圖4 BnFAD2多肽的免疫效果鑒定Fig.4 Immune effect identification of BnFAD2 polypeptide

M1: PageRuler預染蛋白質相對分子質量標準(Thermo); M2:Pierce非預染蛋白質相對分子質量標準(Thermo); 1:anti-BnFAD2純化后10倍稀釋樣本經原性上樣緩沖液處理; 2：anti-BnFAD2純化后10倍稀釋樣本經非還原性上樣緩沖液處理 。圖5 BnFAD2兔源多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of anti-BnFAD2 rabbit-derived polyclonal antibody by SDS-PAGE

2.3 甘藍型油菜品種W-4不同世代FAD2蛋白表達鑒定

果莢總蛋白質、葉片總蛋白質以及內質網蛋白質通過BCA法測定每個樣本濃度后，樣本的上樣量總蛋白質為每孔2 μg，內質網蛋白質為每孔1 μg，進行FAD2蛋白的Western blotting檢測。其結果如圖6所示，WT、W-4-T3代、W-4-T7代果莢以及WT、W-4-T3代、W-4-T7代成熟葉片的總蛋白質以及內質網蛋白質均能在95 000左右檢測到條帶，WT條帶最高，而W-4-T7代最弱。葉片中，3個樣本差異不明顯。

3 討 論

A圖中抗原為果莢總蛋白。1，4，7為W-4-T7代；2，5，8為W-4-T3代；3，6，9為WT；B圖中抗原為葉片總蛋白。1，4，7為W-4-T7代；2，5，8為W-4-T3代；3，6，9為WT；A，B圖中，1，2，3：一抗為anti-BnFAD2；4，5，6：一抗為anti-actin；7，8，9：一抗為免疫前兔血清;依據一抗種屬選擇相應二抗;C圖抗原，1，2，3：果莢內質網蛋白，樣本依次為WT、W-4-T3代、W-4-T7代。4，5，6：葉片內質網蛋白，樣本依次為WT，W-4-T3代，W-4-T7代。一抗為anti-BnFAD2，二抗為anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody。圖6 甘藍型油菜品種W-4不同世代中FAD2蛋白表達鑒定Fig.6 Identification of FAD2 protein expression in different generations of Brassica napus cultivar W-4

抗體作為哺乳動物被動免疫應答的產物，其對抗原的特異性識別功能已被研究者們成功應用到基因表達水平變化的檢測中。目前，哺乳動物蛋白質檢測抗體的種類齊全，免疫學檢測方法應用較廣泛。植物在與生物脅迫以及非生物脅迫對抗的漫長進化過程中，造成了植物蛋白質編碼基因的多樣性以及蛋白質翻譯后的修飾非常復雜。因此與哺乳動物抗體相比，對其特異性抗體的開發和免疫學方法的應用研究步伐較緩慢。特異性抗體的獲得，其免疫抗原的品質很關鍵。目前多采用體外表達重組蛋白質的方式來獲得高品質抗原[26]。重組全長蛋白質可以提供足夠的特征性抗原表位，用其免疫獲得的多克隆抗體，具有多種表位識別能力，可以更準確地捕獲天然裂解液中的微量抗原蛋白質。而重組全長蛋白質的獲得，受到多種因素的制約，如蛋白質本身的結構特征、蛋白質的大小及其等電點、疏水性等。FAD2是定位于內質網上的膜蛋白，預測相對分子質量大小為44 171，具有4個跨膜區。利用原核表達系統得到其重組蛋白質的難度較大。利用合成生物學，體外合成特征性多肽，再將其偶聯到具有強免疫原性的大分子上，可以解決免疫抗原的獲得問題[27-28]。而多個肽段的混合免疫，使免疫得到的多克隆抗體盡可能多地擁有多個表位的識別，提高抗體對微量抗原的識別能力。

本研究中利用生物信息學分析，獲得油菜BnFAD2蛋白高抗原性多肽序列，經多肽合成后，混合免疫動物獲得抗體。BnFAD2-PA肽段位于跨膜導肽與第一跨膜區之間，是多種植物FAD2的共有序列，BnFAD2-PB肽段位于胞質區域，是油菜FAD2的特異性序列。因此，混合免疫得到的兔源多克隆抗體，對于油菜FAD2有2個表面抗原識別位點，也可以利用其對植物FAD2共有序列的識別能力，應用到其他植物FAD2的檢測鑒定中。

FAD2是將油酸轉化為亞油酸的關鍵酶，而FAD3是將亞油酸轉化為亞麻酸的關鍵酶，這兩個酶同時位于細胞內質網上，在脂肪酸代謝途徑中屬于遞呈關系。有研究結果表明，擬南芥原生質體中，當FAD2和FAD3維持酶活性行使功能時，多以同源二聚體以及異源二聚體的形式存在[22]，其二聚體的比例與產物中亞油酸和亞麻酸的比例有直接關系。前期研究結果表明，FAD2在油菜開花后21 d含量達到最高，成熟期葉片維持一致[29]。W-4轉基因油菜與以往外源導入某種基因來增加或減弱相應蛋白質表達的方法不同，其是在導入含種子特異性啟動子的FAD2某段序列，利用RNAi的方法，有效抑制種子中FAD2的轉錄[30]。本研究中，采用野生型甘藍型油菜品種WT以及RNAi干擾轉基因型油菜品種W-4為試驗材料，提取其果莢和葉片中的總蛋白質，分離收集其內質網蛋白質成分，BnFAD2兔源多克隆抗體均能在免疫印跡反應中檢測到相應物質。果莢樣本中，Western blotting的結果顯示W-4的不同世代樣本FAD2蛋白表達較WT均呈現下降。在成熟葉片樣本中，W-4的不同世代樣本FAD2蛋白表達基本維持一致，提示該RNAi干擾載體中引入的種子特異性啟動子元件，組織特異性作用效果明顯。RNAi干擾轉基因型油菜品種W-4的FAD2組織特異性表達抑制效果，通過該BnFAD2兔源多克隆抗體得到蛋白質水平上的內源性驗證，為相關轉基因油菜品種提供了FAD2蛋白表達的檢測抗體。此外，免疫印跡檢測中，陽性條帶的位置與前期體外研究結果相符[22]，首次驗證內源性油菜FAD2同樣以多聚體的形式在細胞內質網上行使功能，而其多聚體的組合方式及其相應生理功能的調控機制，還需要進一步試驗驗證。