河南大蒜韭蔥黃條病毒的分子鑒定及其系統(tǒng)進化分析

高丹娜， 吳淑華， 涂麗琴， 干射香， 程兆榜， 姚秋菊， 魏利輝， 周益軍，朱月林， 季英華

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所,河南 鄭州 450000)

大蒜(Allimu.sativumL.)是一種重要的特色蔬菜，在中國已有兩千多年的栽培歷史[1]。由于大蒜適應(yīng)性廣，經(jīng)濟價值高，種植廣泛，目前中國大蒜種植總面積達8.1×105hm2，已成為世界上最大的大蒜生產(chǎn)和消費國[2-3]。隨著大蒜種植規(guī)模的擴大，大蒜上病毒病的危害也不斷出現(xiàn)，成為影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素。大蒜上病毒病的發(fā)生常會造成植株葉片出現(xiàn)花葉、褪綠、植株扭曲等癥狀，嚴重時會導致蒜頭瓣少或不分瓣，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣[4]。由于生產(chǎn)上大蒜主要通過鱗莖以無性繁殖方式進行擴繁，病毒會通過蒜頭(蒜種)直接傳播至下一茬，因此病毒病對于大蒜的危害往往是相對長期的，且具有累加效應(yīng)，這種累加效應(yīng)不僅影響在大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)上，也會影響蒜種質(zhì)量，造成蒜種的退化，加劇對大蒜的危害，困擾大蒜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前有報道可以侵染危害大蒜的植物病毒有多種，主要分布在3個屬：馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)、麝香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)和蔥屬X病毒屬(Allexivirus)，其他如番茄斑萎病毒屬、斐濟病毒屬等也有部分成員可以侵染危害大蒜[5]。

韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus，LYSV)是一種蚜傳植物病毒[6]，其侵染危害對象包括大蒜、韭蔥等多種蔥屬(Allium)植物[7]，導致寄主植物葉片出現(xiàn)黃色條紋，鱗莖質(zhì)量顯著減小，影響作物產(chǎn)量，有報道顯示其侵染危害大蒜造成減產(chǎn)可高達54%[8-9]。LYSV最早于1978年由Bos等發(fā)現(xiàn)并命名[10]，之后該病毒不斷擴散蔓延，在墨西哥[11]、土耳其[12]、厄瓜多爾[13]、印度[14]、塞爾維亞[15]、克羅地亞[16]、美國[17-19]、日本[20]、捷克[21]、阿根廷[22]、法國[8]等多個國家和地區(qū)發(fā)生危害，成為一種在世界范圍發(fā)生危害的主要病毒。中國早在2001年就有LYSV的發(fā)生危害報道，目前LYSV在浙江[23]、廈門[24]、黑龍江[25]、湖南[26]等地都有發(fā)生危害的報道，威脅當?shù)刈魑锇踩a(chǎn)。

LYSV是一種正義單鏈 RNA 病毒，分類上屬于馬鈴薯Y病毒屬，病毒粒子為線狀，無包膜，長度為815～820 nm，基因組全長10 142 bp，5′端具有病毒基因組結(jié)合蛋白VPg，3′端具有Poly(A)，含1個開放閱讀框(ORF)，翻譯產(chǎn)生1個多聚蛋白質(zhì)，多聚蛋白質(zhì)再通過酶解形成包括外殼蛋白(CP)在內(nèi)的10個有功能的成熟蛋白[23]，其中 CP 是病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，也是該屬病毒種間分類的重要參考指標[27-28]。

河南是中國大蒜第二大產(chǎn)區(qū)，常年栽培面積達1.3×105hm2[2]，近年來當?shù)卮笏馍喜《静〕识喟l(fā)態(tài)勢，2019年本研究在對河南大蒜上病毒病進行調(diào)查時，對當?shù)卮笏獠《静悠愤M行了田間采集，經(jīng)過室內(nèi)分子檢測及序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當?shù)卮笏馍洗嬖贚YSV的感染。

1 材料與方法

1.1 供試病樣

病樣為2019年采自河南開封疑似感染病毒病的大蒜樣本，樣本采集后用液氮冷凍存放于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix、ExTaq酶和克隆載體PMD 18-T購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，2×TaqMaster Mix購自Vazyme公司，大腸桿菌菌株TOP 10感受態(tài)細胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，引物委托Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 病樣總RNA提取

取保存于-80 ℃冰箱中的大蒜病樣，將其置于液氮中用研缽磨成粉末，采取Trizol法[29]提取總RNA，提取后放在-80 ℃冰箱備用。

1.4 LYSV的RT-PCR檢測

以病樣總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)體系(10.0 μl)為：模板RNA 0.5 μl，5×Prime Script RT Master Mix 2.0 μl，RNase-Free H2O 7.5 μl。反應(yīng)程序：37 ℃保溫 15 min，85 ℃變性 5 s，4 ℃保存。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用韭蔥黃條病毒特異性檢測引物LYSV1和LYSV2(表1)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 10 μl，ddH2O 7 μl，LYSV1和LYSV2各1 μl，cDNA 1 μl，總體系20 μl；反應(yīng)程序：94 ℃ 變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。在0.5×TAE電泳緩沖液中，經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并檢測拍照。

表1 本研究用到的引物

1.5 LYSV CP 基因克隆

根據(jù)韭蔥黃條病毒外殼蛋白氨基酸序列設(shè)計引物LYSVCP_F和LYSVCP_R(表1)，以檢測結(jié)果為陽性的病樣總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行RT-PCR擴增。CP基因擴增體系： 10×ExTaqBuffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上下游引物各 1.0 μl，cDNA 1.5 μl，ExTaqDNA聚合酶 0.5 μl，ddH2O 18.0 μl，總體積 25.0 μl。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，47 ℃ 45 s，72 ℃ 55 s，循環(huán) 34 次；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于0.5×TAE電泳緩沖液中經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后得到的目的片段參照膠回收試劑盒說明書進行回收純化后將目的片段與PMD-18T載體在16 ℃下過夜連接，連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，并涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上，在37 ℃ 條件下倒置過夜培養(yǎng)，挑取平板上的克隆進行菌落PCR和酶切鑒定，鑒定無誤后將菌液送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進行序列測定。

1.6 序列分析

序列測定完成后根據(jù)擴增引物去除兩端的冗余序列，序列多重比對、同源性分析使用ClustalX、BioEdit、DNAstar等軟件及NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)完成，聚類分析及進化樹構(gòu)建采用MEGA6軟件(MEGA、美國)的鄰近法(Neighbor-joining)完成，進化樹的可信度使用1 000次自導復制(Bootstrap)驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

本研究2019年對河南大蒜上病毒病進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)當?shù)卮笏獯嬖谝伤撇《靖腥镜牟≈辏l(fā)病大蒜植株葉片上出現(xiàn)明顯的黃色褪綠斑塊，有些呈點狀，有些呈條狀，病株偶有矮化現(xiàn)象。在田間調(diào)查過程中，我們發(fā)現(xiàn)該病在河南多個蒜區(qū)均有發(fā)生，田塊間發(fā)病程度差異比較大，重發(fā)田塊的發(fā)病率達30%，但零星發(fā)生田塊居多，未見整個田塊全發(fā)生或毀田的情況。

2.2 韭蔥黃條病毒的檢測

為明確病樣感染的病毒種類，田間樣品采集后，我們對采集的樣品提取了總RNA并進行RT-PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在利用引物LYSV1和LYSV2進行檢測時，采集的38份疑似病樣中，有33份擴增到了約為300 bp大小的條帶，與目的條帶(304 bp)大小相近(圖1)，而健康的對照樣品中沒有擴增到相應(yīng)大小的條帶。這些結(jié)果初步說明在河南采集的大蒜病樣中可能存在韭蔥黃條病毒的感染。

M:DL 5 000 marker;CK:健康植株;a:19HNGD1-1;b:19HNGD1-2;c:19HNGD1-3;d:19HNGD1-4;e:19HNGD1-5;f:19HNGD1-6;g:19HNGD1-7*;h:19HNGD1-8;i:19HNGD1-9;j:19HNGD1-10;k:19HNGD1-11;l:19HNGD1-12;m:19HNGD2-1;n:19HNGD2-2;o:19HNGD2-3*;p:19HNGD2-4;q:19HNGD2-5;r:19HNGD2-6;s:19HNGD2-7;t:19HNGD2-8。標星號樣品為抽選CP基因克隆樣品。圖1 病樣中韭蔥黃條病毒(LYSV)的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR detection of leek yellow stripe virus(LYSV) in diseased garlic plants

2.3 韭蔥黃條病毒CP基因克隆

為進一步確定檢測到的病毒是LYSV，我們針對LYSV的CP基因設(shè)計了1對引物：LYSVCP-F和LYSVCP-R(表1)，RT-PCR結(jié)果(圖2)顯示33份陽性樣品均能擴增到大小約為860 bp左右的條帶，與預(yù)期目的條帶大小(864 bp)吻合，說明該條帶就是本研究要擴增的CP基因目的條帶。

隨機抽選3個樣品(19HNGD1-7，19HNGD2-3，19HNGD2-10)，對擴增到的目的條帶(圖2)進行回收，回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TOP10)感受態(tài)細胞后通過菌落PCR方法篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)酶切驗證(圖2)后送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進行序列測定(每個樣品隨機抽選2個陽性克隆)。

左:LYSV CP基因RT-PCR擴增;右:PMD18T-CP 酶切驗證(BamH I) 。左圖，M:DL 5 000 marker;a:19HNGD1-7;b:19HNGD2-3;c:19HNGD2-10;19HNGD1-7、19HNGD2-3、19HNGD2-10為用于LYSV CP基因克隆的樣品編號。右圖，M：DL 5 000 marker;1、2、3:篩選到的CP陽性克隆編號。圖2 CP基因的RT-PCR擴增(左)及陽性克隆酶切驗證(右)Fig.2 RT-PCR amplification of CP gene (left) and identification of positive clone by enzyme digestion (right)

2.4 韭蔥黃條病毒CP基因序列分析

對送測后獲得的序列信息進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的6個CP基因序列全長均為864 bp，編碼1個由289個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約32 300的蛋白質(zhì)，序列之間的同源性超過98.6%，BLAST分析結(jié)果顯示，其與LYSV(HQ258895)同源性最高，暗示了其屬于LYSV的1個分離物。

為進一步分析其分類地位，我們使用ClustalX軟件將本研究測定的LYSVCP基因序列及已公開的其他LYSV分離物CP基因序列進行了比對(表2)，并利用MEGA6軟件，使用臨近法(Neighbor-Joining，NJ)、Kimura 2-parameter模型重建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。

表2 6個樣品CP基因序列與已公布LYSV CP基因序列的同源性

各支上的數(shù)字是1 000次Bootstrap自導復制的置信度。●：本研究測定的LYSV河南分離物；○：之前報道的LYSV河南分離物。圖3 根據(jù)LYSV CP基因核苷酸序列一致性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence consistency of CP gene of LYSV

由CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖3)可以看出，本研究獲得的6個LYSV河南分離物全部聚類到LYSV分支中，說明本研究從河南分離到的病毒為LYSV。對進化樹分析可以得出LYSV分為2個大組，LYSV病毒中國分離物、西班牙分離物、墨西哥分離物、印度分離物及巴西的1個分離物和澳大利亞的1個分離物共同聚類到第1組(Group I)，而LYSV病毒阿根廷分離物、澳大利亞2個分離物、日本分離物及巴西的1個分離物聚類到第2組(Group II)。針對聚類到第1組的LYSV病毒中國分離物，他們也分布于不同的小分支中，其中本研究報道的河南分離物與中國廈門等地的2個分離物共同聚類到1個小分支中，他們相對近緣。而與其他LYSV分離物(如浙江分離物、云南分離物、臺灣分離物、黑龍江分離物、湖北分離物、山東分離物等)聚類到不同的小分支，相對遠緣(同源性低于85%)，其中與之前報道的LYSV河南分離物之間的同源性僅為81%(圖3、表2)，暗示了本研究報道的LYSV與之前報道的存在較大的差異，可能屬于不同類型或不同株系。

3 討 論

大蒜是一種重要的蔬菜作物，除作為調(diào)味品外，在醫(yī)學研究和應(yīng)用上也占有重要地位[30]，因此其經(jīng)濟價值相對較高，種植面積比較廣泛。隨著種植區(qū)域的擴大，大蒜上病毒病的種類也異常復雜，目前有報道可以侵染危害大蒜的病毒種類至少有20種[5]，這些病毒以單獨侵染或復合侵染的方式危害大蒜，影響大蒜產(chǎn)量[31]。加之大蒜多采用無性繁殖的方式生產(chǎn)，病毒會通過鱗莖直接傳播，不斷加劇對大蒜的危害,造成產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降、品種退化等[8，32]。

河南省大蒜栽培面積達1.3×105hm2，面積、產(chǎn)量均居全國第2位[3]，在中國大蒜生產(chǎn)、供給中起著重要作用。本研究對2019年采自河南表現(xiàn)花葉癥狀的大蒜樣品進行檢測時發(fā)現(xiàn)LYSV的感染，進一步的基因克隆及序列分析結(jié)果顯示，其屬于LYSV的1個分離物。早在2002年Chen等[23]就曾報道河南大蒜上存在LYSV，因此本研究并不是LYSV在河南發(fā)生危害的首次報道，但是CP基因序列分析結(jié)果顯示，本研究獲得的LYSV分離物與2002年報道的河南LYSV分離物之間的同源性僅為81%(而與中國廈門等地的LYSV分離物同源性超過98%)，二者在系統(tǒng)進化樹上也未聚類到同一小分支，相對遠緣。在馬鈴薯Y病毒屬中，CP基因核苷酸序列同源性76%～77%是病毒種的分類閾值[27-28]，因此本研究報道的河南分離物屬于LYSV，但是該分離物與之前報道的LYSV河南分離物存在較大的差異，這種差異可能不僅僅體現(xiàn)在基因序列的同源性上，二者在致病性及危害損失上也可能存在差異，暗示河南大蒜上可能出現(xiàn)了新的LYSV類型或株系。由于大蒜多通過無性繁殖進行生產(chǎn)，同時各地大蒜品種也存在頻繁的調(diào)運，因此很難判斷河南新的LYSV類型出現(xiàn)的原因是當?shù)夭《就ㄟ^變異演化產(chǎn)生還是通過種苗等方式從外地傳入，但生產(chǎn)上應(yīng)對這類病毒的危害密切關(guān)注，防止該病毒擴散蔓延造成更大的危害。

鑒于目前有報道可以侵染危害大蒜的病毒種類有多種，因此在調(diào)查過程中，除LYSV外，本研究也對采集樣品中的其他病毒如洋蔥黃矮病毒(Onion yellow dwarf virus，OYDV)、大蒜A病毒(Garlic virus A，GarV-A)、大蒜B病毒(Garlic virus B，GarV-B)、大蒜X病毒(Garlic virus X，GarV-X)、青蔥潛隱病毒(Shallot latent virus，SLV)等進行了檢測，結(jié)果在樣品中也檢測到了OYDV、SLV等病毒，且普遍存在復合侵染的現(xiàn)象，這些結(jié)果說明河南大蒜上病毒病種類比較復雜，因此要明確當?shù)夭《痉N類及群體變化特征還需要更廣泛的樣品采集及更系統(tǒng)的種類調(diào)查。