布魯氏菌BP26蛋白對鼠源樹突狀細胞分化及抗原提呈作用

徐 龍， 曹小安， 劉永生， 周建華， 張廣林， 孫晶晶， 李玲霞， 趙永婕，胡永浩

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的人畜共患傳染病，具有流行廣泛、危害極大的特點。近年來，布魯氏菌給中國的公共衛生與安全帶來了新挑戰。由于布魯氏菌沒有明顯的外毒素，其依靠外膜蛋白、脂多糖及Ⅳ型分泌系統發揮毒力并通過抑制溶酶體的相關功能抵抗細胞凋亡和逃離細胞死亡與降解。Brucella在宿主發揮細胞免疫和體液免疫時，具有逃避能力。Brucella在侵入機體后，主要侵染胚胎細胞及巨噬細胞，胞內生存和繁殖是其主要致病機理，其免疫機制在逃離宿主的免疫系統時發揮了重要作用[1]。

諸如OMP10、OMP19和BP26等外膜蛋白刺激BM-DCs(小鼠分離髓源樹突狀細胞)后，BM-DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達及培養上清液中IL-12、IL-10、INF-γ、TNF-α的分泌均顯著增加。而OMP25和OMP31刺激BM-DCs后會顯著抑制部分表面分子的表達及炎性細胞因子IL-12、IL-6、INF-γ、TNF-α的分泌[2]。Dohmer等[3]也發現了其他種類的分泌蛋白質，但對這些蛋白質的功能仍處于探索階段，具體機制也尚未研究透徹。劉景福等[4]發現BP26蛋白在BP26免疫模型上能夠形成明顯的遲發型變態反應。王勇等[5]發現重組蛋白BP26作為檢測抗原建立的間接ELISA方法效果較為理想，可適用于臨床布魯氏菌感染的檢測。王芳等[6]發現基于BP26建立的間接ELISA檢測方法在檢測Brucella時不能對細菌種屬及其來源進行有效區分，通過檢測BP26抗體不能對羊布魯氏菌病進行有效區分和診斷。對小鼠接種OMP或L7/L12抗原的DNA疫苗或重組蛋白質可有效對抗布魯氏菌有毒株的攻擊感染。Saadi等[7]從OMP31、BP26、BLS、DnaK和L7/L12蛋白中篩選了5個新的T細胞表位，并基于上述蛋白質制成多表位肽疫苗使其穩定有效表達，在未來有可能用于預防或治療布魯氏菌病。

雖然BP26能夠產生強力的抗體，但有效的抗原在細菌侵染宿主細胞時發揮的作用和分子機制尚不明確。本試驗選取布魯氏菌外膜蛋白基因BP26進行全基因擴增，并成功將其構建到pET-30a質粒中進行穩定表達，獲得了重組質粒pET-30a-BP26。說明該蛋白質可在大腸桿菌內穩定表達。利用分子生物學的方法對BP26蛋白進行分析，獲得了BP26蛋白的相關特性的基本信息，為未來研究布魯氏菌侵襲宿主后BP26蛋白會通過何種信號通路對機體產生影響及相關調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質粒 布魯氏菌陽性基因組、質粒pET-30a(+)為中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物細菌病創新團隊保存。大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 血清與抗體 羊布魯氏菌陽性血清為中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物細菌病創新團隊保存，辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊IgG購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 主要生化試劑 2×EasyTaq? PCR SuperMix (+dye )、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、IPTG購自寶生物工程(大連)有限公司,卡那霉素、30% Acr制膠液、RPMI1640細胞培養基、PBS(pH=7.2)購自北京索萊寶科技有限公司，High Affinity Ni-Charged Resin FF購自南京金斯瑞生物科技有限公司，Tryptone、Yeast Extract購自OXOID公司。

1.1.4 試驗動物、病毒及試劑 28～42日齡BALB/C小鼠由中國農業科學院蘭州獸醫研究所動物中心提供，所有動物試驗按照單位相關倫理要求進行。

胎牛血清購自美國Glbco公司。重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白介素-4(rmIL-4)購自美國PeproTch公司。單克隆抗體為兔抗鼠的PE-CDllC、FITC-MHCⅡ、FITC-CD86、APC-CD80、APC-CD40，均購自美國BD Biosciences公司。陽性對照為布魯氏菌脂多糖(LPS)，購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 使用Primer Premier5.0篩選出最優引物，上下游引物兩端添加保護性堿基并分別引入EcoR Ⅰ和SalⅠ 2個酶切位點，并對密碼子進行適當優化，引物：BP26-F:5′-CCGGAATTCGCCACCATGCAGGAGAATCAGATGACG-3′,BP26-R:5′-CCGGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGCTTGATTTCAAAAACGAC-3′),酶切位點以下劃線標出。設計完成的引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成，擴增片段長度為666 bp。

1.2.2 布魯氏菌BP26基因的PCR擴增及克隆 以布魯氏菌基因組作DNA模板，擴增體系參照說明書進行配置。采用2×EasyTaq?PCR SuperMix(+dye)和合成的引物在56 ℃退火溫度下擴增獲得BP26目的片段，將擴增后的產物在1.15%瓊脂糖凝膠上電泳，參照膠回收試劑盒說明書對切取的目的條帶進行回收。用EcoRⅠ和SalⅠ對回收后的目的片段與pET-30a載體質粒在37 ℃水浴鍋中雙酶切4～5 h后回收。 用T4連接酶體系16 ℃過夜連接線性化酶切的質粒和目的基因產物。將全部連接產物轉入DH5α中，冰浴30 min后42 ℃ 熱激90 s，迅速轉移至冰上放置3 min。在含200 mg/L的Kan+抗性固體培養基上培養，37 ℃ 倒置過夜培養后挑取陽性克隆的菌落小搖后進行PCR擴增及酶切鑒定。將鑒定成功的質粒送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.2.3 布魯氏菌BP26重組蛋白的表達及純化 將構建成功的質粒轉入BL21中保存，挑取單個陽性克隆的菌落接種至5 ml含Kan抗性液體LB中37 ℃過夜培養。吸取2 ml培養的菌液至200 ml含Kan抗性液體LB中，37 ℃，200 r/min培養。當菌液OD600值達到0.6～0.8時，設置誘導溫度為16 ℃、25 ℃、37 ℃ 3個梯度，設置IPTG的終濃度分別為1.00×10-3mol/L、5.00×10-4mol/L、2.50×10-4mol/L、1.25×10-4mol/L、1.00×10-4mmol/L 5個梯度，設置誘導時間為3 h、4 h、5 h、6 h 4個梯度。各設置條件誘導結束后收獲菌液，8 000 r/min，4 ℃，離心30 min，棄上清液，用少許0.01 mol/L的PBS再次懸浮沉淀后用同等條件離心，收集沉淀。用Lysis equilibration buffer (LE Buffer)對沉淀進行懸浮后，超聲破碎儀裂解，超聲5 s，間歇2 s，工作時間為1 h。破碎結束后以上述同等條件離心分離上清液和沉淀，分別取上清液與沉淀40 μl和10 μl， 5×SDS-PAGE Loading Buffer充分混勻煮沸10 min后進行SDS-PAGE，完成后使用考馬斯亮藍染色液對蛋白質膠室溫染色4 h后，再以脫色液充分脫色，分析重組蛋白質BP26的表達水平。

將成功鑒定的布魯氏菌BP26蛋白表達液裝入經LE Buffer平衡后的His-Tag Ni柱中，收集流穿液后以LE Buffer洗脫4個柱體積后，以含20 mmol/L濃度咪唑LE Buffer為起點對柱內的沉淀進行洗脫，柱底端口液體流速控制在1.0～1.5 ml/min。含20 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗滌5個柱體積， 含40 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗滌3個柱體積，含60 mmol/L濃度咪唑LE Buffer、含160 mmol/L濃度咪唑LE Buffer各洗滌1個柱體積，含250 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗脫2個柱體積，含20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、160 mmol/L濃度咪唑LE Buffer流出液各收集2 ml，含250 mmol/L濃度咪唑LE Buffer流出液全部收集，純化獲得試驗所需的目的蛋白質。

1.2.4 布魯氏菌BP26重組蛋白的Western-Blot分析 參考文獻[8]中的方法，將稀釋液調整為10倍稀釋的Casein封閉液，優化一抗孵育時間為1 h，二抗孵育時間為45 min，對BP26蛋白進行Western-Blot分析。

1.2.5 小鼠髓源樹突狀細胞的體外誘導培養 選取4只SPF級的42～56日齡BALB/c雌性小鼠，參照文獻[9]分離小鼠髓源樹突狀細胞(BM-DCs)。參考文獻[10]中的方法用rmGM-CSF和rmIL-4刺激，使分離制備的骨髓原代細胞分化為未成熟DCs。DCs培養至第6 d，調整BP26蛋白終濃度為100 μg/ml刺激DCs細胞；調整LPS 終濃度為100 ng/ml刺激DCs細胞，并將該組選作陽性對照，開展后續試驗。

1.2.6 布魯氏菌BP26蛋白刺激鼠源樹突狀細胞 設置LPS與重組 BP26蛋白分別刺激BM-DCs 24 h后，收集DCs，1 500 r/min離心7 min，收集上清液進行與介導細胞炎癥相關細胞因子的檢測。BM-DCs沉淀用含有5%胎牛血清、pH為7.2的PBS懸浮，對DCs活性以PE-CDllC抗體4 ℃ 避光染色30 min后經流式細胞儀進行分析。DCs共刺激分子表達分析： 設置PE-CD11C、APC-CD40、FITC-MHCⅡ三色共染為試驗組一，設置PE-CD11C、APC-CD80、FITC-CD86為試驗組二。同時設置同型對照和單染管，抗體4 ℃染色30 min，加入1 ml含有5%胎牛血清的PBS，1 500 r/min，7 min離心收集DCs。上述PBS重懸細胞，用FAC SC alibur流式細胞儀進行檢測，FlowJo軟件進行數據分析。

1.2.7 參與炎癥反應的細胞因子檢測 將BM-DCs沉淀以Trzol法提取細胞RNA并測定其濃度，使用Qiagen Omniscript RT Kit將RNA反轉錄為cDNA。采用2×SYBR Green Abstart PCR Mix，以cDNA為模板，參考文獻[11]設計需要檢測的細胞因子引物，各體系與擴增條件參照說明書。試驗設置3個獨立重復，擴增結束后記錄Ct值 。

1.3 統計學數據分析

采用FlowJo V10軟件對經流式細胞儀檢測獲得的結果進行分析，采用統計軟件Graphpad Prism 8進行繪圖，采用SPSS V25.0軟件對試驗組和對照組的流式數據與Ct值進行差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 表達質粒的鑒定

基于挑取的陽性克隆菌落進行PCR擴增，并以挑取的菌落培養的菌液作為DNA模板再次進行PCR擴增，2次均擴增出666 bp大小的條帶。參照質粒小提試劑盒使用說明書提取菌液質粒，并用EcoRⅠ和SalⅠ將重組表達質粒pET-30a-BP26雙酶切后瓊脂糖電泳，分別得到大小正確的目的片段和載體片段(圖1)。

M：2 000 DNA marker ；1：質粒pET-30a-BP26酶切產物。圖1 表達載體雙酶切圖譜Fig.1 Restriction enzyme map of expression vector

2.2 BP26蛋白的重組表達

對純化后的BP26蛋白進行SDS-PAGE電泳后經卡馬斯亮藍染色后脫色，最佳誘導條件為：溫度37 ℃，IPTG濃度5×10-4mol/L，時間5 h時。誘導后可在30 000左右出現條帶(圖2)，與預期條帶大小最符合，條帶最為清晰，證明該條件下BP26蛋白在BL21(DE3)中的表達量最高。

M：蛋白質marker;1：pET-30a-BP26上清液;2：pET-30a-BP26沉淀。圖2 SDS-PAGE鑒定pET-30a-BP26表達結果Fig.2 Expression of pET-30a-BP26 by SDS-PAGE

將純化誘導表達上清液中的BP26蛋白的各濃度咪唑洗脫液經SDS-PAGE鑒定分析，發現在泳道1有BP26蛋白和大量雜蛋白質出現，證明誘導表達上清中的蛋白質并未完全與High Affinity Ni-Charged Resin FF結合；泳道2出現了與泳道1相同的情況，證明LE Buffer據有將蛋白質從高親和力樹脂上洗脫下來的能力，泳道3～6并未出現明顯的蛋白質條帶，但是從泳道7、泳道8可以觀察出BP26蛋白的表達量較多，而雜蛋白質條帶幾乎沒有。說明20～160 mmol/L濃度咪唑洗脫液可以充分將雜蛋白質從親和樹脂上洗脫下來，洗脫效果最佳的咪唑濃度為40 mmol/L(圖3)。

M：蛋白質marker；1：BP26流穿液；2：LE Buffer洗滌后結果；3：含20 mmol/L 咪唑LE Buffer洗滌結果；4：含40 mmol/L 咪唑LE Buffer洗滌結果 5：含60 mmol/L咪唑LE Buffer洗滌結果；6：含160 mmol/L咪唑LE Buffer洗滌結果 ；7、8：含250 mmol/L咪唑LE Buffer洗脫結果。圖3 BP26蛋白純化電泳檢測Fig.3 Electrophoresis detection of BP26 protein

2.3 BP26蛋白Western blotting檢測結果

表達產物經SDS-PAGE電泳后轉印到0.45 μm PVDF膜上，封閉液作用后、經一抗、二抗孵育后ECL顯色，在30 000左右出現目的條帶(圖4)，說明表達產物的反應原性良好，符合后續試驗要求。

M：蛋白marker；1、2： pET-30a- BP26 (+)。圖4 布魯氏菌BP26蛋白Western-Blot結果Fig.4 Western-blot results of Brucella BP26 protein

2.4 BP26蛋白基本性質分析

ExpASy在線軟件分析結果顯示，BP26蛋白總長約為250個氨基酸，相對分子質量大小為26 550，等電點為6.39；帶正、負電荷氨基酸殘基數均為24。BP26蛋白在280 nm處的摩爾消光系數為5 960 mol/L；BP26蛋白N端為Met，在哺乳動物體內半衰期約為30 h，在酵母體內半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內半衰期大于10 h。

BP26蛋白在溶液中的不穩定指數為27.93，推測BP26蛋白性質穩定。BP26蛋白的脂肪族指數為92.16，親水性平均系數為-0.030，BP26屬跨膜蛋白且其外膜蛋白質具有較高的親水性，屬親水蛋白質。對BP26蛋白的二級結構進行預測，發現α螺旋比例為41.20%，β轉角比例為4.80%，無規則卷曲比例為36.80%，延長鏈比例為17.20%，可見BP26蛋白的二級結構以α螺旋為主(圖5)。BP26蛋白的信號肽區域為第1～28位氨基酸，信號肽剪切位點在28～29位氨基酸之間。對BP26蛋白的氨基酸序列中的抗原表位進一步進行分析，數據顯示序列中存在8個潛在的抗原表位，平均抗原傾向性系數為1.016 4。

圖5 布魯氏菌BP26蛋白二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of Brucella BP26 protein

2.5 BM-DCs體外誘導培養及純度檢測

在細胞因子rmGM-CSF和rmIL-4的共同作用下，4只BALB/C鼠分離的BM-DCs平均含量可達到1 ml 1.3×106細胞，符合試驗要求。倒置顯微鏡觀察DCs的形態特征及生長狀況。在培養24 h后，可觀察到DCs體積較小，為均一的圓形，部分貼壁生長。至第3 d可觀察到DCs集落群并且DCs體積較第1 d的體積大。培養至第6 d，部分DCs脫離集落群，呈現不規則形態并形成類似于樹杈狀的突起(圖6)。將培養第6 d的DCs用PE- CD11C染色標記后用流式細胞儀分析DCs活性，結果顯示：分離制備的DCs活性可達到85%以上(圖7)，符合試驗要求，可用于后續試驗。

A:骨髓原代細胞培養24 h;B:誘導第3 d;C,D:誘導第6 d ；A,C,D:放大×20;B:放大×40。圖6 用含rmGM-SF和rmIL-4完全培養基不同時間誘導的細胞形態Fig.6 Induction of cell morphology at different time with complete medium containing rmGM-SF and rmIL-4

圖7 DCs活性Fig.7 Activity detection of dendritic cells

2.6 布魯氏菌BP26蛋白對DCs成熟及細胞因子表達

如圖8所示，LPS組與DC對照組相比，經LPS刺激作用后，DCs的成熟呈促進趨勢。同時發現在BP26刺激BM-DCs后，試驗組設置的CD40、MHC-Ⅱ、CD86和CD80的雙染區域比值與空白DC組對比后，有明顯的上升趨勢，故能判定布魯氏菌BP26蛋白對BM-DCs的成熟具有促進作用。SPSS軟件分析結果顯示，LPS與BP26雖然對BM-DCs的成熟均有促進作用，但APC-CD40、APC-CD80、FITC-CD86組中差異不明顯，而在FITC-MHCⅡ組中呈現出較明顯的差異。

圖8 流式細胞術檢測BP26和LPS處理后DC表面共刺激分子的表達Fig.8 The expression of costimulatory molecules on dendritic cells treated with BP26 and LPS by flow cytometry

2.7 參與DCs炎癥反應細胞因子的檢測

如圖9所示，LPS組與DC對照組相比，經LPS刺激作用后，TNF-α的表達量差異顯著(P<0.05)。同時發現在BP26刺激BM-DCs后，IL-10的表達量與DC對照組相比呈下降趨勢且差異極顯著(P<0.01)，IL-12的表達量與DC對照組相比呈現下降趨勢且差異顯著(P<0.05)。分析結果說明，布魯氏菌BP26蛋白能夠引起細胞的炎癥反應，促進炎性細胞因子的釋放。

圖9 參與BM-DCs炎癥反應細胞因子顯著差異性分析Fig.9 Analysis of significant differences in cytokines involved in BM-DCs inflammatory response

3 討 論

本研究獲得了高效可溶的BP26重組蛋白，與預測結果相一致。純化后刺激BM-DCs的研究結果表明，BP26蛋白能促進BM-DCs分化成熟及誘導細胞炎癥的發生，發現其呈現MHCⅡ抗原提呈作用，并能對IL-10與IL-12的分泌產生抑制作用。

BP26蛋白作為布魯氏菌外膜蛋白質家族重要的毒力因子[12]，對該蛋白質的研究集中于利用BP26蛋白或其家族成員與其他毒力因子相連進而制成多表位肽疫苗對動物進行相關免疫，從而預防布魯氏菌病的發生[13]。但是對于BP26在刺激細胞后激活的信號通路和由此產生的活化信號的研究較少。此外，本試驗通過生物信息學工具進行分析發現該蛋白質有大量親水性抗原區域暴露，親水性高，這與試驗獲得高效可溶性表達蛋白質的結果一致。通過表達獲得的可溶性活性高的重組蛋白質，為蛋白質與宿主互作功能研究奠定了可靠的基礎。

樹突狀細胞(DCs)是在抗原提呈中扮演著重要角色，目前研究認為，DCs為體內提呈功能最強大的專職抗原提呈細胞(APC)[14]，是機體免疫應答的始動者 。將此次試驗構建的重組蛋白BP26作為抗原刺激BM-DCs，通過流式細胞術分析BM-DCs表面標志物的變化，發現布魯氏菌BP26蛋白能促進BM-DCs成熟分化，表明該蛋白質參與細胞炎癥反應，在細菌對宿主細胞的侵入過程中發揮重要作用。

CD86是抗原呈遞細胞上的表達分子，可提供T細胞活化和存活所必需的共刺激信號[15]。它是T細胞表面上2種蛋白質CD28抗原和CTLA-4的配體，其主要與CD28結合[16]，該蛋白質與CD28抗原的結合是激活T細胞的共刺激信號。這些分子與CD80抗原一起提供必要的刺激，以引發T細胞抵抗抗原呈遞細胞呈遞的抗原[17]。本研究發現重組BP26蛋白刺激BM-DCs后這些表面分子表達不同程度升高，表明該蛋白能夠活化T細胞反應，而MHCⅡ表面分子表達顯著升高表明該蛋白質通過MHCⅡ途徑提呈抗原。

CD80是CD86活化T淋巴細胞時的協同刺激因子，在自身免疫監控、體液免疫應答及移植反應中發揮重要作用[18]。CD80屬于免疫球蛋白超家族，其受體是CD28和CD152(CTLA4)[19-20]。CD80在活化B淋巴細胞、活化T淋巴細胞、巨噬細胞、外周血單核細胞及樹突狀細胞中均可表達；在非活化B淋巴細胞、紅細胞、粒細胞及核細胞上不表達[21-22]，而多個研究結果表明，布魯氏菌感染宿主后能夠產生強烈的BP26蛋白相關表位的抗體[23-24]，細胞因子檢測結果證明BP26能夠激發細胞炎癥反應，刺激免疫細胞活化。本研究通過重組BP26蛋白抗原刺激BM-DCs后CD80表面分子升高，說明BP26在細菌侵入宿主引起機體產生免疫效應的過程中發揮著重要的作用。