喹諾酮類抗生素對兩種水生生物氧化應激系統的影響研究

鄭棟赫 楊雷 沈洪艷

摘 要：為探究水生生物受喹諾酮類抗生素影響的作用機制，選取2種典型的喹諾酮類抗生素——氧氟沙星和諾氟沙星，將斜生柵藻和斑馬魚分別置于其溶液中暴露，在第5，10，15 d，檢測并比較氧氟沙星和諾氟沙星質量濃度為0，30，60，120，360 mg/L時對斑馬魚和斜生柵藻體內SOD和CAT氧化應激指標的影響。結果表明：喹諾酮類抗生素對斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢相似，說明斑馬魚和斜生柵藻SOD活性受影響的程度基本相同;喹諾酮類抗生素對斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現不同趨勢，說明不同水生生物維持體內細胞抗氧化環境平衡的能力不同;喹諾酮類抗生素對斑馬魚試驗組SOD活性、CAT活性影響的最大值及最小值均高于斜生柵藻試驗組，說明2種喹諾酮抗生素對斑馬魚和斜生柵藻SOD活性和CAT抗氧化應激反應強度的影響存在明顯差異。研究結果為進一步研究喹諾酮類抗生素對水生生物的生態毒性效應提供了科學根據。

關鍵詞：環境毒理學;斑馬魚;斜生柵藻;氧氟沙星;諾氟沙星;SOD;CAT

中圖分類號：X171.5?文獻標識碼：A

文章編號：1008-1542（2020）04-0374-07

doi：10.7535/hbkd.2020yx04011

氧氟沙星（OFXL）和諾氟沙星（NFXL）都屬于喹諾酮類抗生素，普遍用于疾病防治[1]。環境中的抗生素一方面來源于工業污染[2]，另一方面來源于生活和生產，科研人員對此進行了大量研究。例如，李彥文等[3]檢測出廣州市蔬菜中含有喹諾酮藥物殘留;章強等[4]發現養殖業用于生物體治療的抗生素隨糞便等進入了環境中。在海洋水體環境[5]、水產養殖場廢水[6]、山東境內地表水[7]及深圳河[8]都曾檢出過喹諾酮類抗生素且處于高濃度水平范圍[9-11]。此外，土壤中的抗生素對土壤生態也有著重要影響[12]。

2011年，王荻等[13]研究了諾氟沙星對鱘魚體內超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。結果表明，當諾氟沙星質量分數為40 mg/kg時，SOD活性出現最大值。喹諾酮抗生素容易引起動物細胞活性發生變化[14]，導致人類SOD含量顯著下降[15]?？股厥俏⑸锏拇x產物，對藻類具有抑制作用和毒性[16-18]。陳柳芳[19]采用不同濃度的氧氟沙星處理斜生柵藻，發現其半數致死量均高于50 mg/L，安全質量濃度為5 mg/L以下。研究表明，抗氧化防御系統能夠保持機體內自由基的平衡[20-22]，使系統內的SOD將氧自由基轉化成H2O2和O2[23]。抗氧化防御系統對于活性氧自由基的清除能力也反映出機體的生理生化狀況[24]。

SOD活性和過氧化氫酶（CAT）活性是生物氧化應激系統的重要指標。本文采用室內試驗方法，將斜生柵藻和斑馬魚分別置于諾氟沙星和氧氟沙星溶液中暴露，通過測定并比較斜生柵藻和斑馬魚SOD活性和CAT活性2項生化指標，分析喹諾酮類抗生素對水生生物氧化應激系統的影響。

1?試驗材料

1.1?試驗生物

斑馬魚，購自當地水產市場，平均體長為（4.0±0.2）cm，平均體質量為（0.22±0.03）g，試驗前用曝氣3 d的脫氯自來水馴養斑馬魚7 d，水溫為（25±1）℃，pH值為6.8～7.5。

斜生柵藻（FACHB-13），購自中國科學院淡水藻種庫，采用BG-11型培養基擴大培養，置于人工氣候培養箱中，設置水溫為（25±1）℃，pH值為6.8～7.5，光照晝夜比為12 h/12 h。

1.2?喹諾酮類抗生素

氧氟沙星，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：100986-85-4，純度大于98%;諾氟沙星，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：70458-96-7，純度大于98%。

1.3?測定試劑盒

SOD試劑盒（羥胺法）、CAT可見光試劑盒（可見光法）、蛋白定量測定試劑盒（考馬斯亮藍法），均購自南京建成生物工程研究所。

2?試驗方法

2.1?生物培養

設置喹諾酮類抗生素的質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，試驗周期為96 h，探究斑馬魚急性毒性96 h-EC50。利用Origin 8.0軟件對斑馬魚死亡率進行線性擬合，進而求得喹諾酮類抗生素對斑馬魚在不同質量濃度的死亡率。

由喹諾酮類抗生素對斑馬魚的急性致死作用可見，隨著藥物質量濃度的增大，斑馬魚死亡率顯著上升。諾氟沙星和氧氟沙星對斑馬魚的96 h-EC50分別為0.229 g/L和0.427 g/L。結合本試驗設計方案，設置抗生素質量濃度為0，30，60，120，360 mg/L。

采用暴露染毒法，將斑馬魚直接暴露在一定質量濃度的抗生素脫氯自來水中。配制抗生素溶液：用0.1%（質量分數，下同）的鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液，然后用NaOH調節pH值為6.8～7.5。隨機選取生長健康的斑馬魚分為5組，每組30尾。每組脫氯自來水4 L，分別設置0，30，60，120，360 mg/L 5個濃度組進行試驗，試驗期間不投喂食物。于試驗的第5，10，15 d測定斑馬魚內臟團中的SOD活性和CAT活性。

在無菌條件下，將斜生柵藻接種入盛有BG-11培養基的250 mL錐形瓶中，在光照培養箱中進行培養，光照強度為3 500 lux，晝夜光照周期為（12 h光照+12 h黑暗），溫度設置為（25±1）℃，每日定時人工搖晃4次。配制抗生素溶液：用0.1%鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液，然后用NaOH調節pH值為6.8～7.5。將配制完畢的抗生素母液按照一定比例混入斜生柵藻培養基中，分別設置0，30，60，120，360 mg/L 5個濃度組進行試驗。于試驗的第5，10，15 d測定斜生柵藻的SOD活性和CAT活性。

2.2?指標測定

從各試驗組取10尾斑馬魚，解剖取出內臟團，用0.9%生理鹽水清洗，稱重后按質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，并置于勻漿器進行充分勻漿，2 500 r/min離心10 min。采用考馬斯亮藍總蛋白試劑盒測定斑馬魚內臟團蛋白質的含量，然后分別用SOD試劑盒、CAT可見光試劑盒測定相應指標。

取藻液20 mL進行離心 （5 000 r/min，5 min），棄去上清液，用PBS緩沖溶液清洗底部藻泥3次。取20 mL藻液，在冰浴條件下使用超聲波進行細胞破碎，單次超聲時間為5 s，使用2 mm探頭，設置功率為300 W，破碎時間為10 min。隨后在低溫條件下進行離心（8 000 r/min，10 min）。取上清液，檢測SOD活性和CAT活性。

2.3?數據處理

采用SPSS17.0對試驗數據進行統計分析，用Origin8.0進行作圖處理，結果以（平均數±標準差）表示。其中：*（P<0.05）表示與空白對照組相比有顯著差異;**（P<0.01）表示與空白對照組相比有極顯著差異。

3?結果與分析

3.1?諾氟沙星對斑馬魚內臟團及斜生柵藻SOD和CAT的影響

暴露期間，斑馬魚SOD活性出現先誘導后抑制的變化趨勢（見圖1）。與對照組相比，最大誘導率為19.7%，試驗組呈現極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為36.4%，并呈現極顯著差異（P<0.01）。

斑馬魚CAT活性出現逐漸抑制的趨勢（見圖2）。與對照組相比，最大抑制率為30.3%，并呈現極顯著差異（P<0.01）。

暴露期間，斜生柵藻SOD活性出現先誘導后抑制的變化趨勢（見圖3）。與對照組相比，最大誘導率為64.9%，試驗組呈現極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為19.4%，并呈現極顯著差異（P<0.01）。

斜生柵藻CAT活性出現逐漸誘導的趨勢（見圖4）。與對照組相比，最大誘導率為152.6%，并呈現極顯著差異（P<0.01）。

3.2?氧氟沙星對斑馬魚內臟團及斜生柵藻SOD和CAT的影響

斑馬魚SOD活性出現先誘導后抑制的變化趨勢（見圖5）。與對照組相比，最大誘導率為21.8%，呈現極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為27.5%，并呈現顯著差異（P<0.05）。

斑馬魚CAT活性出現逐漸抑制的趨勢（見圖6），最大抑制率為26.2%，試驗組呈現極顯著差異（P<0.01）。

暴露期間，斜生柵藻SOD活性出現先誘導后抑制的變化趨勢（見圖7）。與對照組相比，最大誘導率為124.3%，試驗組呈現極顯著差異（P<0.01），最大抑制率為5.27%。

斜生柵藻CAT活性出現逐漸誘導的趨勢（見圖8）。與對照組相比，最大誘導率為98.0%，并呈現極顯著差異（P<0.01）。

研究發現，在試驗周期和抗生素質量濃度相同的條件下，諾氟沙星對斑馬魚抗氧化指標的影響均大于斜生柵藻，其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值，兩者最大值差距15.08倍。氧氟沙星對斑馬魚抗氧化指標的影響均大于斜生柵藻，其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值，兩者最大值差距27.38倍。這可能表明喹諾酮類抗生素在藻類和魚類所引起的抗氧化應激反應的強度不同。受試生物抗氧化指標見表1。

4?討論與分析

隨著暴露時間的延長，諾氟沙星對斑馬魚內臟團和斜生柵藻SOD活性的影響均表現為先誘導后抑制的趨勢，這可能是由于前期受試生物的氧化應激系統被激活，從而能適應環境中的諾氟沙星。第15 d，由于諾氟沙星的積累，細胞受到一定的氧化損傷，無法清除多余的活性氧并造成SOD活性的降低，使受試生物受到一定的損害[25]。氧氟沙星對斑馬魚內臟團和斜生柵藻SOD活性的影響表現為先誘導后抑制的趨勢。其對斑馬魚和斜生柵藻氧化應激系統的作用效果如下：前期斑馬魚體內受到氧氟沙星的影響，產生大量機體活性自由基激活氧化應激系統，SOD活性被誘導;后期組織細胞受到一定氧化損傷，氧自由基過量積累導致SOD活性被抑制。由此可見，受脅迫的斑馬魚和斜生柵藻SOD的活性變化趨勢具有一定的相似性，喹諾酮類抗生素對不同水生生物的抗氧化作用效果可能也相同。

諾氟沙星試驗組中斑馬魚CAT活性出現逐漸抑制的趨勢，試驗第15 d時360 mg/L質量濃度組的抑制率為30.3%。CAT能夠清除SOD和機體長鏈脂肪酸代謝產生的H2O2[26]，由于SOD誘導率比抑制率低，可能未引起CAT活性的增加;第15 d時SOD活性抑制效果顯著，產生的H2O2含量降低，從而引起CAT活性降低。氧氟沙星試驗組中CAT活性出現逐漸抑制的趨勢，試驗第15 d時360 mg/L質量濃度組的抑制率為26.2%。這可能是在后期SOD活性受到極顯著抑制（P<0.01），使CAT活性逐漸降低的緣故。研究指出，機體內抗氧化酶類如CAT可以反映機體受損傷的狀態[27]。本研究中諾氟沙星和氧氟沙星造成斜生柵藻CAT活性上升，表明當藻細胞受到脅迫時，CAT增多用于清除H2O2，保持藻細胞抗氧化環境平衡;但后期斜生柵藻CAT活性沒有下降，可能是試驗期間內藻細胞內多余的H2O2未清除完畢，這表明斑馬魚和斜生柵藻受脅迫后氧化應激系統中CAT的作用強度有所不同。

5?結?論

1）喹諾酮類抗生素對斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢相似，表明喹諾酮類抗生素對斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響程度相同。由于斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的最大值和最小值出現較大差異，且喹諾酮類抗生素對斑馬魚SOD活性的影響均高于對斜生柵藻SOD活性的影響，說明喹諾酮類抗生素對不同水生生物氧化應激反應的強度存在明顯差異。

2）喹諾酮類抗生素對斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現不同趨勢，其中對斑馬魚CAT活性的影響有抑制作用，對斜生柵藻CAT活性的影響有誘導作用，說明不同水生生物維持體內細胞抗氧化環境平衡的能力存在差異。由于喹諾酮類抗生素對斑馬魚CAT活性最大值和最小值的影響均高于對斜生柵藻CAT活性的影響，說明喹諾酮類抗生素對不同水生生物氧化應激反應的強度存在明顯差異。

3）喹諾酮類抗生素對水生生物氧化應激系統的影響過程非常復雜，本文僅比較了斑馬魚和斜生柵藻受喹諾酮類抗生素影響的作用機制，并對SOD活性和CAT活性的最大值和最小值進行了分析。今后將進一步采用更加系統全面的分析方法，探究更多種類抗生素對水生生物氧化應激系統的影響。

參考文獻/References：

[1]?ANGULO F J，COLLIGNON P，POWERS J H，et al.The World Health Organization ranking of antimicrobials according to their importance in human medicine[J].Clinical Infectious Diseases，2009，49（1）：132-141.

[2]?葉賽，盧江濤，宗虎民，等.液相色譜-串聯質譜測定養殖海水中氟苯尼考殘留[J].沈陽農業大學學報，2008，39（3）：368-370.

YE Sai，LU Jiangtao，ZONG Humin，et al.Determination of florfenicol residues in aquiculture seawater by high performance liquid chromatography-tandem mass specterometry [J].Journal of Shenyang Agricultural University，2008，39（3）：368-370.

[3]?李彥文，張艷，莫測輝，等.廣州市蔬菜中喹諾酮類抗生素污染特征及健康風險初步研究[J].環境科學，2010，31（10）：2445-2449.

LI Yanwen，ZHANG Yan，MO Cehui，et al.Preliminary study on occurrence and health risk assessnment of quinolone antibiotics in vegetables from Guangzhou，China[J].Environmental Science，2010，31（10）：2445-2449.

[4]?章強，辛琦，朱靜敏，等.中國主要水域抗生素污染現狀及其生態環境效應研究進展[J].環境化學，2014，33（7）：1075-1083.

ZHANG Qiang，XIN Qi，ZHU Jingmin，et al.The antibiotic contaminations in the main water bodies in China and the associated environmental and human health impacts[J].Environmental Chemistry，2014，33（7）：1075-1083.

[5]?LINDBERG R，JARNHEIMER P A，OLSEN B，et al.Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards[J].Chemosphere，2004，57（10）：1479-1488.

[6]?LI W，SHI Y，GAO L，et al. Investifation of antibiotics in mollusks from coastal water in the Bohai Sea of China[J].Environmental Pollution，2012，162：56-62.

[7]?張慧，郭文建，朱晨，等.山東省主要河流中抗生素污染組成及空間分布特征[J].中國環境監測，2019，35（1）：89-94.

ZHANG Hui，GUO Wenjian，ZHU Chen，et al.Composition and spatial distribution characteristics of antibiotics in main rivers of Shandong Province[J]. Environmental Monitoring in China，2019，35（1）：89-94.

[8]?葉計朋，鄒世春，張干，等.典型抗生素類藥物在珠江三角洲水體中的污染特征[J].生態環境，2007，16（2）：384-388.

YE Jipeng，ZOU Shichun，ZHANG Gan，et al. Characteristics of selected antibiotics in the aquatic environment of the Pearl River Delta，south China[J].Ecology and Environment， 2007，16（2）：384-388.

[9]?朱婷婷，宋戰鋒，尹魁浩，等.深圳西麗水庫抗生素殘留現狀及健康風險研究[J].環境污染與防治，2014，36（5）：49-53.

ZHU Tingting，SONG Zhanfeng，YIN Kuihao，et al.Study on current sitation and health risk of antibiotics residue in source water of Xili Reservoir in Shenzhen[J].Environmental Pollution & Control，2014，36（5）：49-53.

[10]歐丹云，陳彬，陳燦祥，等.九龍江下游河口水域抗生素及抗性細菌分布[J].中國環境科學，2013，33（12）：2243-2250.

OU Danyun，CHEN Bin，CHEN Canxiang，et al.Distribution of antibiotics residue and resistant bacteria in the downstream and estuarine area in Jiulong River[J].China Environmental Science，2013，33（12）：2243-2250.

[11]吳青峰，洪漢烈.環境中抗生素污染物的研究進展[J].安全與環境工程，2010，17（2）：68-72.

WU Qingfeng，HONG Hanlie.Progress of research on antibiotic contamination[J].Safety and Environmental Engineering，2010，17（2）：68-72.

[12]王加龍，劉堅真，陳杖榴，等.恩諾沙星殘留對土壤微生物功能的影響[J].生態學報，2005，5（12）：523-530.

WANG Jialong，LIU Jianzhen，CHEN Zhangliu，et al.Effects of enrogloxacin residues on the functions of soil microbes[J].Acta Ecologica Sinica，2005，5（12）：523-530.

[13]王荻，李紹戊，馬濤，等. 諾氟沙星對兩種鱘體內SOD活力影響的比較研究[J].中國畜牧獸醫，2011，38（7）：34-37.

WANG Di，LI Shaowu，MA Tao，et al. A comparison study on the effects of norfloxacin on the superoxide

dismutase activities in two kinds of sturgeons[J].China Animal Husbandry &Veterinary Medicine， 2011，38（7）：34-37.

[14]李萍，王永銘，程能能，等.喹諾酮類藥物對離體兔軟骨細胞的毒性[J].中國新藥與臨床雜志，2004，23（6）：331-335.

LI Ping，WANG Yongming，CHENG Nengneng，et al.Chondrotoxicity of quinolones on cultured chondrocytes of rabbit[J].Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies，2004，23（6）：331-335.

[15]TALLA V，VEERARDDY P.Oxidative stress induced by fluoroquinolones on treatment for complicated urinary tract infections in Indian patients[J].Journal of Young Pharmacists，2011，3（4）：304-309.

[16]管超，毛杰.抗生素對水生態環境毒性效應研究概述[J].資源節約與環保，2014（2）：136.

[17]王志強，朱琳.常用抗菌藥對藻類的急性毒性效應研究[J].中獸醫醫藥雜志，2006，25（6）：17-20.

WANG Zhiqiang，ZHU Lin.The acyte toxicity tests of antibiotic on algae[J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，2006，25（6）：17-20.

[18]皋德祥，宋國梁，葛利云，等.2種抗生素對球等鞭金藻的毒理學研究[J].浙江農業科學，2013（2）：179-182.

[19]陳柳芳.三種喹諾酮類抗生素對斜生柵藻的毒性效應[D].長春：東北師范大學，2010.

CHEN Liufang.The Toxicity Effect of Three Quinolone Antibiotics on Scenedesmus Obliquus[D].Changchun：Northeast?Normal University，2010.

[20]南芝潤，范月仙.植物過氧化氫酶的研究進展[J].安徽農學通報，2008，14（5）：27-29.

NAN Zhirun，FAN Yuexian.Advance of researches on catalase in plants[J].Anhui Agricultural Science Bulletin，2008，14（5）：27-29.

[21]張坤生，田薈琳.過氧化氫酶的功能及研究[J].食品科技，2007，35（31）：8-10.

ZHANG Kunsheng，TIAN Huilin.Research and function of catalase in organism[J].Food Science and Technology，2007，35（31）：8-10.

[22]陳金峰，王宮南，程素滿.過氧化氫酶在植物脅迫響應中的功能研究進展[J].西北植物學報，2008，28（1）：188-193.

CHEN Jinfeng，WANG Gongnan，CHENG Suman. Progress about catalase function in plant stress reactions[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2008，28（1）：188-193.

[23]朱友芳，嚴志洪，洪萬樹.高錳酸鉀對中國花鱸的毒性效應[J].生態毒理學報，2011，6（2）：176-181.

ZHU Youfang，YAN Zhihong，HONG Wanshu. Toxic effects of potassium permanganate on perch lateolabrax maculates[J].Asian Journal of Ecotoxicology，2011，6（2）：176-181.

[24]高問，武鵬鵬，沈洪艷.土霉素廢水對斑馬魚的生物毒性效應研究[J].河北科技大學學報，2019，40（1）：38-44.

GAO Wen，WU Pengpeng，SHEN Hongyan.Study of the biological toxicity of oxytetracycline wastewater on zebrafish[J].Journal of Hebei University of Science and Technology， 2019，40（1）：38-44.

[25]LIU H， GOONERATE R， HUANG X， et al. A rapid in vivo zebrafish model to elucidate oxidative stress-mediated PCBI126：Induced apoptosis and developmental toxicity[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2015， 84： 91-102.

[26]FRIDOVICH I.Superoxide dismutase：An adaptayion to a paramagnrtic gas[J].The Journal of Biological Chemistry，1989，264：7761-7764.

[27]ZHOU Z，SON J，HARPER B，et al.Influence of surface chemical properties on the toxicity of engineered zincoxide nanoparticles to embryonic zebrafish[J].The Beilstein Journal of Nanotechnology，2015，6：1568-1579.