基于細(xì)胞代謝活性的抗菌材料抗菌性能快速檢測(cè)研究進(jìn)展

呂想 滿東楠 林如夢(mèng) 唐喬 劉鵬鵬

摘 要：抗菌性能檢測(cè)是衡量抗菌材料性能的關(guān)鍵指標(biāo)。傳統(tǒng)的抗菌檢測(cè)方法步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員和環(huán)境的要求較為嚴(yán)格，與現(xiàn)代抗菌檢測(cè)發(fā)展要求較不相匹配。而抗菌性能的快速檢測(cè)可縮短檢測(cè)周期、提高材料利用率、降低廢棄物處理難度，因此建立一種簡(jiǎn)單高效的抗菌性能快速檢測(cè)方法成為抗菌行業(yè)發(fā)展的迫切任務(wù)。本項(xiàng)目擬建立一種將2，3，5-三苯基氮化四氮唑（TTC）應(yīng)用于快速檢測(cè)，以細(xì)菌代謝活性為基礎(chǔ)具有高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)的抗菌材料抗菌性能的快速檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：抗菌活性;抗菌性能快速檢測(cè);2，3，5-三苯基氮化四氮唑

抗菌材料是指以抗菌劑作為有效抗菌成分的材料[1]。抗菌材料中的抗菌劑成分具有能夠抑制微生物生長(zhǎng)繁殖甚至殺滅微生物的功能，用這些抗菌材料制成的各種制品可減少細(xì)菌交叉感染的機(jī)會(huì)，從而達(dá)到長(zhǎng)期衛(wèi)生、安全的目的。近年來，隨著抗菌材料在醫(yī)療用品、生活用品、食品包裝材料和建筑材料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，抗菌材料的開發(fā)和應(yīng)用已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。在抗菌材料研制開發(fā)過程中不可避免的要用到抗菌性能檢測(cè)的方法，目前抗菌性能檢測(cè)方法均需采用培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)，通過平板計(jì)數(shù)測(cè)算抗菌活性，具有檢測(cè)周期長(zhǎng)（一般3至5天），操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，且對(duì)操作環(huán)境和人員技術(shù)能力要求較高。建立一種簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的材料抗菌性能檢測(cè)方法已迫在眉睫。2，3，5-三苯基氮化四氮唑（2，3，5-triphenyltetramLiumchloride，縮寫為TTC），細(xì)菌代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將其還原，其還原產(chǎn)物為不溶于水的深紅色三苯甲臢（TTF）。TTC溶于水中成無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲臢（TTF），TTF比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化。嗜中溫性需氧菌在其新陳代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可以使無色的TTC還原為紅色的TTF的特性，故可以將TTC作為細(xì)菌生長(zhǎng)的指示劑[2-3]。而將該原理應(yīng)用于抗菌材料抗菌性能的研究尚未見研究報(bào)道。

1 抗菌材料抗菌性能快速檢測(cè)研究進(jìn)展

1.1 現(xiàn)有方法

目前抗菌材料抗菌性能檢測(cè)的方法主要有振蕩法、吸收法、貼膜法及瓊脂擴(kuò)散法等，根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同可主要分為抗細(xì)菌能力檢測(cè)和抗真菌能力檢測(cè)兩大類。

1.1.1 抗細(xì)菌能力的測(cè)定方法及對(duì)比

抗細(xì)菌能力檢測(cè)方法分為三大類，分別是貼膜培養(yǎng)法和浸漬法、接觸法或包埋法及振蕩法。貼膜培養(yǎng)法和浸漬法

需要菌液與樣品接觸培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)過程中需要控制的條件較多，包括細(xì)菌活性、細(xì)菌所需營(yíng)養(yǎng)、濕度、溫度等條件，有可嚴(yán)格定量的優(yōu)點(diǎn)。接觸法或包埋法采用使樣品直接接觸混有菌液的培養(yǎng)基或包埋其內(nèi)的方法，進(jìn)行不同時(shí)間的培養(yǎng)后，觀察細(xì)菌在樣品及其周圍的生長(zhǎng)情況和樣品受侵蝕情況，存在周期長(zhǎng)和不便作為產(chǎn)品質(zhì)量控制的定量評(píng)價(jià)的缺點(diǎn)。振蕩法是將樣品浸泡在一定濃度的菌液中，對(duì)其不斷進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，定時(shí)采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算抗菌率，適用于織物、泡沫塑料、一次性衛(wèi)生用品等的測(cè)定。

1.1.2 抗真菌能力的測(cè)定方法

抗真菌能力檢測(cè)方法分為兩大類，分別是接觸法和暴露法。接觸法與檢測(cè)抗細(xì)菌能力的方法一致，將樣品貼于培養(yǎng)基上，在樣品及培養(yǎng)基表面均勻地噴灑一定量的混合孢子懸液，培養(yǎng)一定時(shí)間，定期觀察，觀察菌生長(zhǎng)情況分等級(jí)評(píng)價(jià)抗菌材料的抗霉菌性。暴露法是將樣品暴露于霉菌生長(zhǎng)的場(chǎng)所后測(cè)定樣品的長(zhǎng)霉程度，有操作不便和污染環(huán)境的缺點(diǎn)。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍

上述各種檢測(cè)方法都對(duì)操作人員的操作要求較為嚴(yán)格并且都需要一定的培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)周期比較長(zhǎng)，為抗菌檢測(cè)帶來諸多不便。所以設(shè)計(jì)一種新的快速檢測(cè)方法成為抗菌制品發(fā)展的需要。

2 TTC顯色檢測(cè)原理及現(xiàn)有應(yīng)用

2.1 檢測(cè)原理

TTC顯色檢測(cè)法即是基于TTC這一種氧化還原染料與活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)，被還原為紅色的TTF，其基本原理是活細(xì)胞中的呼吸酶的活躍情況能較正確地表現(xiàn)細(xì)胞活性的強(qiáng)弱，同時(shí)氧化還原染料會(huì)再呼吸酶的作用下使細(xì)胞著色，所以可以根據(jù)著色情況來判斷細(xì)胞的活力[4]。

2.2 現(xiàn)有應(yīng)用

TTC法的優(yōu)點(diǎn)是可以應(yīng)用于許多活細(xì)胞上且測(cè)定結(jié)果都比較精確，但存在有無活性的界限不明確，容易出現(xiàn)測(cè)量值偏高，上色所需時(shí)間較長(zhǎng)，容易褪色等缺點(diǎn)。目前，TTC法主要用于農(nóng)業(yè)科學(xué)方面，常用于：

2.2.1 花粉生活力測(cè)定

其基本原理是花粉中呼吸酶的活躍情況能較正確地反映其生活力的強(qiáng)弱，同時(shí)氧化還原染料能在呼吸酶的作用下著色，因此可根據(jù)著色情況來判斷花粉的生活力。具體操作過程為：第一步，取少數(shù)花粉置于載玻片上，加1-2滴TTC溶液，蓋上蓋玻片。第二步，將制片放置35℃恒溫箱中15min，然后在低倍鏡下觀察。凡是染成紅色的花粉，其生活力為強(qiáng)，淡紅的次之，無色的為不具活力的花粉或不育花粉。第三步，觀察2-3個(gè)制片，每片取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)100粒，然后計(jì)算花粉的活力百分率[5]。

2.2.2 植物根系活力測(cè)定

顯色。取根和側(cè)根，每重復(fù)分別均稱取一定重量（約0.5g）樣品，依次加人0.4%TTC溶液和（1/15）mol/L磷酸緩沖液各5mL，充分混合，并使根尖切段完全浸入上述反應(yīng)液中，于37℃的恒溫箱內(nèi)以黑暗條件培養(yǎng)2h，以使根尖切斷顯色[6]。

2.2.3 植物種子活力測(cè)定

配制0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，避光保存，溶液一旦變成紅色不能再用。樣品處理與紅墨水染色法相同。每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入0.05%、0.10%、0.50%TTC溶液，然后將其放在30℃左右的恒溫箱中1.5h左右，隨后將TTC溶液倒掉，并用水反復(fù)沖洗幾次，觀察染色情況。胚部呈紅色的則具有生活力，呈淺紅色的具有較弱的生活力，無色的便是無活力種子。但發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)呈淺紅色的一般也可發(fā)芽，所以呈淺紅色的也算具有發(fā)芽能力[7]。

2.2.4 各種活細(xì)胞的活力測(cè)定

將在一定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑，TTC會(huì)顯不同的顏色，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母會(huì)顯現(xiàn)深紅色，次之顯粉紅色，微紅色的或不顯色的為野生酵母。使用TTC平板法篩選西瓜酒酵母可以篩選出產(chǎn)酒精[8]。

3 TTC顯色方法建立

3.1 材料

M-H瓊脂培養(yǎng)基、M-H肉湯培養(yǎng)基、TTC、琥珀酸鈉、質(zhì)控菌株，供試菌株、藥敏試紙。

3.2 試驗(yàn)方法

3.2.1 TTC顯色培養(yǎng)基指示劑適宜濃度的確定

3.2.1.1 制備試驗(yàn)菌液

取質(zhì)控菌株新鮮斜面，挑取1塊接種環(huán)菌苔移至9mL肉湯培養(yǎng)基，置35℃下培養(yǎng)4-6h，制成新鮮菌液，將新鮮菌液用0.9%氯化鈉滅菌溶液倍比稀釋成含菌量為50-150CFU/mL的供試菌液。

3.2.1.2 1%TTC儲(chǔ)備液的制備

取1gTTC、2g琥珀酸鈉溶于100mL生理鹽水，121℃滅菌鍋處理15min備用。

3.2.1.3 含TTC梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基的制備

配制M-H瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15min。分別取

0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的TTC儲(chǔ)備液加入到100mL經(jīng)高壓滅菌冷卻至50-60℃的M-H瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)搖勻，配成6級(jí)含TTC系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基。

3.2.1.4 TTC系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌菌落的顯色反應(yīng)及抑菌性試驗(yàn)

按《中國(guó)藥典》附錄微生物限度檢查法中菌落計(jì)數(shù)的方法，將含菌量為50-150CFU/mL的供試菌液1mL加入滅菌平皿中，用含不同TTC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的M-H瓊脂培養(yǎng)基15mL澆碟（每質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1組，每組6個(gè)平皿），同時(shí)以不加TTC的M-H瓊脂培養(yǎng)基15mL澆碟（6個(gè)平皿）作為對(duì)照組。35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h，觀察各試驗(yàn)組和對(duì)照組的菌落顏色并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均菌落數(shù)。

3.2.2 TTC顯色快速藥敏試驗(yàn)

為了獲取供試菌株TTC顯色快速藥敏試驗(yàn)所需時(shí)間和敏感度方面的數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)將參考藥敏紙片試驗(yàn)的結(jié)果及藥物分類代表，選取多種獸醫(yī)臨床常用藥物的藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。①制備試驗(yàn)菌液：取供試菌株制備0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊募?xì)菌懸液;②制備TTC顯色培養(yǎng)基：配制M-H瓊脂培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻至50-60℃，按1000mL加3mL的比例加入1%TTC儲(chǔ)備液，配成含0.003%TTC的顯色培養(yǎng)基，倒入無菌培養(yǎng)皿;③接種平板：用1個(gè)無菌棉拭子蘸取菌液，并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液。用拭子涂布整個(gè)瓊脂平板表面，反復(fù)涂布幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60°，保證涂布均勻。蓋上平皿，室溫下放置3-5min，使培養(yǎng)基表面的水分蒸發(fā)，然后貼藥敏紙片;④貼藥敏紙片：用無菌鑷子將藥敏紙片貼于平皿上，每個(gè)平皿貼6種藥敏紙片。紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不小于24mm，紙片中心距平板邊緣不小于15mm。貼上紙片15min內(nèi)，把平皿倒放在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h;⑤孵育：TTC顯色半固體瓊脂置37℃孵育2、3、4、5、10、15、18h，取出測(cè)量抑菌環(huán)直徑;⑥結(jié)果判讀：按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，以敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）的形式解釋結(jié)果;⑦質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)用質(zhì)控菌對(duì)所有鑒定用試劑及藥敏分析用抗生素紙片進(jìn)行質(zhì)量控制，以符合預(yù)期結(jié)果和NCCLS的藥敏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

4 展望

近年來，抗菌材料的使用更加廣泛，抗菌材料的開發(fā)和應(yīng)用已逐漸成為研究的熱點(diǎn)，在抗菌材料研制開發(fā)過程中不可避免的要用到抗菌性能檢測(cè)的方法，本項(xiàng)目以抗菌材料為研究對(duì)象，根據(jù)細(xì)菌代謝過程產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶還原TTC顯色的原理，通過抗菌材料與細(xì)菌的接觸培養(yǎng)、TTC顯色劑顯色反應(yīng)、顯色程度或變色時(shí)間、TTC還原產(chǎn)物TTF的濃度測(cè)定等多方面的研究，擬建立一種準(zhǔn)確、有效的基于細(xì)菌代謝活性的抗菌材料抗菌性能快速定性、定量檢測(cè)方法。快速檢測(cè)方法可以用于抗菌產(chǎn)品的生產(chǎn)在線抽檢，隨著生產(chǎn)檢測(cè)控制產(chǎn)品質(zhì)量，也可以用于抗菌性能演示和消費(fèi)者自行檢測(cè)，確保讓消費(fèi)者自己了解所售產(chǎn)品的抗菌性能，促進(jìn)抗菌行業(yè)健康快速的發(fā)展。

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基金項(xiàng)目：

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201910356020），

浙江省質(zhì)量技術(shù)基礎(chǔ)建設(shè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20180116）。