hERβ重組質粒pEGFP-C1-hERβ對PC-3M細胞凋亡的影響

于鎧銘

【摘? ? 要】前列腺癌（PCa）是男性常見的惡性腫瘤，在美國男性癌癥病死率為第2位，僅次于肺癌。近十年來PCa發病率在許多國家中（包括中國在內的）有逐年上升的趨勢。目前我國PCa的發病率在男性泌尿系統腫瘤的位居第3位。目前普遍認為雌激素與雌激素受體（ER），特別是ERβ在PCa的發生、發展、惡變和轉移過程中發揮重要作用。研究發現：雌激素與抗雌激素對前列腺癌PC-3細胞株均有抑制作用;抗雌激素對前列腺癌DU145細胞株有抑制作用。本實驗通過重塑ERβ在前列腺癌PC-3M細胞株中的表達，研究和分析ERβ對前列腺癌細胞凋亡信號傳導途徑的影響。

【關鍵詞】前列腺癌? 雌激素? 抗雌激素

中圖分類號：G4? ? ? 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1672-0407.2020.15.200

一、材料和方法

（一）材料

人前列腺癌細胞株PC-3M（ATCC）。真核表達載體pcDNA3.1、脂質體Lipofetion2000（Invitrogen），pEGFP-C1質粒、限制性內切酶BamH I、HindⅢ、TA克隆載體（pMD18-T Vector）、T4 DNA連接酶及質粒提取和純化試劑盒（TaKaRa），Trizol（GIBCO），胎牛血清（Hyclone），高保真Taq DNA聚合酶（Sangon）等。ERβ兔抗人多克隆抗體、β-actin羊抗人多克隆抗體、堿性磷酸酶標記與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆抗體（SANTA CRUZ）;Caspase-3、Caspase-9兔抗人多克隆抗體（北京中山金橋生物技術有限公司）。本實驗所用引物均為上海生工公司合成。

（二）方法

1. pEGFP-C1-hERβ重組質粒的構建及鑒定。在前期工作中，應用基因重組技術，構建pEGFP-C1-hERβ重組質粒;采用質粒提取試劑盒，按產品說明提取質粒，應用HindⅢ和Xhol進行雙酶切鑒定及雙向自動測序分析儀測序分析鑒定構建的質粒。

2.細胞培養與轉染。人激素非依賴性前列腺癌細胞株PC-3M細胞（1×106）接種于100 mL培養瓶中，于IMDM培養基（含10%小牛血清）， 37℃，5% CO2條件下常規培養。當貼壁細胞達到70%-80%融合時，取重組質粒6μg，以脂質體法轉染細胞，培養24 h。同時設陰性對照組（只加脂質體，不加質粒）和空質粒對照組（轉染pEGFP-C1）。然后換完全培養基（含10%小牛血清）繼續培養48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達，收集細胞備用。

3. 免疫細胞化學染色分析。轉染細胞48 h后離心，收集細胞（同上），調整細胞濃度為1×106，取10μL滴加到用多聚賴氨酸處理過的玻片上，室溫放置30 min;以4%多聚甲醛固定，Triton-X 100 洗10 min;3% H2O2 孵育25 min（以阻斷內源性過氧化物酶）;室溫反應1 h;滴加生物素化羊抗兔IgG于蓋玻片上， 37℃ 孵育30 min;滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，37℃ 孵育30 min;上述每步抗體均為50μL/片，反應后均用PBS洗滌3次。最后于光學顯微鏡下觀察并照相。結果判定：細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。

4.流式細胞儀檢測細胞凋亡峰。將生長狀態良好的PC-3M細胞分為兩組，實驗組轉染pEGFP-C1-hERβ（2μg/mL），對照組轉染pEGFP-C1，培養72 h，分別制成單細胞懸液。用流式細胞儀做單參數分析，每份樣品檢測1×104細胞。

5.吖啶橙染色凋亡細胞。將轉染pEGFP-C1-hERβ和pEGFP-C1質粒的PC-3M細胞經胰酶消化，離心，洗滌，棄上清，細胞計數，調整細胞濃度為1×106/mL。取95μL加入0.1%的吖啶橙（AO），熒光顯微鏡觀察細胞顏色及形態。

6.TUNEL染色分析。取10μL胰酶消化處理后的PC-3M細胞（濃度為1×106/mL），滴加到預先用多聚賴氨酸處理的玻片上，室溫放置30 min。4%多聚甲醛固定30 min。用新鮮配制的3%H2O2，室溫處理10 min。在標本片上加TBS（0.01M） 1∶200新鮮稀釋的Proteinase K，在37℃消化1-15 min。加標記緩沖液20μL/片（以保持切片濕潤）。每張切片取末端脫氧核糖核酸轉移酶（TdT）和地高辛標記的dUTP（DIG-dUTP）各1μL，加入18μL標記緩沖液中并混勻。去除切片上多余液體，加標記液20μL/片。把樣品置于濕盒中，37℃標記2 h。加封閉液50μL/片，室溫30 min后去除封閉液。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50μL/片加至標本片上。在濕盒中，37℃反應30 min。同樣的操作處理鏈霉親和素-過氧化物（SABC）。每步結束后均用0.01M TBS洗滌。采用DAB顯色：染色步驟及結果判定同2.3中DAB顯色。

7. RT-PCR半定量分析。應用Trizol按說明提取100 mL培養瓶中培養的轉染細胞的總RNA，并逆轉錄成cDNA。以β-actin作為內參照，PCR法檢測Bcl-XL、AKt、caspase-3、caspase-9等基因的表達情況。PCR反應條件：94℃預變性5 min，30個循環（94℃ 30s→55℃ 30 s→72℃ 1 min），最后72℃延伸10 min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用GIS數碼凝膠成像系統拍照并測定電泳條帶灰度值，以目的基因與內參β-actin條帶灰度比值表示其含量。

8. Western blot 檢測。轉染后的各組細胞（分組同前），用蛋白刮子刮下，PBS洗滌，利用細胞蛋白裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度（Bio-Rad），每組取50 μg蛋白分別經10% SDS-PAGE電泳分離，用Western blot 檢測caspase-3及caspase-9蛋白表達情況。各組分別以對照組的目的蛋白與β-actin光密度的比值作為內參進行比較。

9. 統計學處理。數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，用SPSS 11.5統計軟件分析，P<0.05。

二、結果

（一） hERβ在PC-3M細胞內的表達

熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，同時應用免疫細胞化學染色法檢測轉染細胞中hERβ的表達。結果顯示：與對照組比較，轉染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細胞，GFP表達陽性;免疫細胞化學實驗結果顯示，與對照組比較，轉染ERβ的細胞，大部分呈陽性染色，尤其是細胞核棕黃色染色明顯。

（二） hERβ促進PC-3M細胞凋亡

1.流式細胞技術檢測。結果顯示：轉染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細胞的實驗組與對照組相比，在G1前出現了亞二倍峰，即為凋亡峰。凋亡細胞數目占總細胞數的13.7%，凋亡細胞明顯增加。

2. 吖啶橙實驗。吖啶橙實驗結果顯示：實驗組細胞出現了被染為桔黃色的凋亡細胞;而對照組細胞則偶見被染為桔黃色的凋亡細胞。說明轉染pEGFP-C1-hERβ質粒可促進細胞發生凋亡。

3.TUNEL檢測。TUNEL實驗結果顯示：與對照組相比，轉染pEGFP-C1-hERβ的細胞，出現陽性染色，胞核呈深棕黃色。細胞大小不一，結構不完整，可見胞質凝縮，核斷裂相。

（三） RT-PCR檢測

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：與對照組相比，實驗組細胞未見抗凋亡基因Bcl-XL表達;而AKt的表達明顯減少;凋亡基因caspase-9的表達則增加，而caspase-3的mRNA表達減少。

（四）Western blot 檢測

Western blot結果顯示：與對照組相比，轉染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細胞，可見17 KD的caspase-3片斷，和37 KD的caspase-9片段。提示轉染細胞中caspase-3和caspase-9的活化。

三、討論

Bardin等研究證明，轉染ERβ到卵巢癌細胞后，可引起細胞凋亡。Cheng等把ERβ基因轉染到前列腺癌細胞株DU145中，細胞增殖抑制，誘導細胞出現凋亡。因此推測ERβ可能是一種腫瘤抑制基因，研究ERβ對前列腺癌細胞凋亡途徑的影響，對前列腺癌患者的治療具有重要的研究意義和臨床應用價值。本實驗顯示ERβ轉染PC-3M細胞后，經流式細胞儀檢測發現，細胞在G1期前出現凋亡峰;鏡下可見細胞核內染色體邊集，呈新月形或馬蹄形分布。上述實驗指標證明，ERβ轉染PC-3M細胞后，誘發細胞出現凋亡。

細胞凋亡調控機制的核心是一類蛋白水解酶，統稱為天冬氨酸蛋白酶（cysteine-requiring aspartate protease，caspase）家族。caspase-3是凋亡過程中激活的關鍵激酶，也是凋亡的主要效應因子。caspase-9與caspase-3一樣，也可以把PARP剪切成85KD的小片段。western blot結果顯示：轉染ERβ的細胞，caspase-3及caspase-9表達明顯增加（P<0.05），實驗結果具有統計學意義。

Bcl-XL是B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-celllymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）Bcl-2家族中的重要成員。Bcl-X基因可翻譯Bcl-XL和Bcl-Xs兩種蛋白，Bcl-XL比Bcl-Xs多出一個BH4結構域，可抑制細胞凋亡，而Bcl-Xs則促進細胞凋亡。研究表明Bcl-XL可通過多條途徑發揮抗凋亡作用：通過穩定線粒體膜電位、阻止線粒體釋放凋亡誘導因子，阻抑caspase的級聯放大效應等。激活后的Akt通過對含有絲氨酸&蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應。PCR結果顯示：轉染ERβ的PC-3M細胞，Bcl-XL和AKt的表達明顯降低。

綜上所述， ERβ引起前列腺癌細胞發生凋亡的可能機制是： ERβ的增加抑制AKt和Bcl-XL基因的活性，使之喪失抑制Apaf-1的功能;促進細胞色素C（Apaf-2）從線粒體內釋放并與Apaf-1結合;進而促進caspase-9（Apaf-3）與之結合并激活，啟動細胞凋亡級聯反應，導致細胞形態學發生改變及核小體間的DNA降解等一系列變化。