宏基因組測序法檢測市售益生菌產品的菌種組成

曹淑曼 王雪涵 田薇

摘要：目的：通過微生物宏基因組測序方法檢測10種市售益生菌產品的菌種組成。方法：從益生菌產品中直接提取微生物宏基因組DNA，采用第二代高通量基因測序方法進行宏基因組測序，對測序結果進行生物信息學分析，確定每種產品中益生菌的菌種組成以及相對豐度。結果：所檢測的10種產品中，僅有2種產品的檢測結果與產品說明中所標注的菌種組成完全相符，其他產品均與各自標注有不符合之處，主要表現為菌種缺失或（和）含有其他混雜菌種。兩次獨立抽樣檢測結果一致。結論：監管部門需要對益生菌產品質量進行嚴格監控，而微生物宏基因組測序技術為監管部門提供了一個檢測益生菌產品菌種組成的新方法。

關鍵詞：益生菌;宏基因組;菌種組成

人體健康與人體共生的各種微生物密切相關，益生菌通過四個主要機制對人體產生有益的影響[1]：通過結合在粘附位點與病原菌競爭來干擾病原菌的定殖[2];改善腸道上皮細胞的屏障功能[3];參與免疫調節[4];通過免疫系統[5]和神經遞質產生對身體其他器官的影響[如γ氨基丁酸（GABA）和5羥色胺][6]。市場上常見的益生菌主要包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的微生物群。例如，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 53103可促進微生物群的關鍵成分與宿主上皮之間的相互作用，潛在地促進了腸道定居微生物的抗炎通路[7]，從而改善腸道微環境;長雙歧桿菌可促進抗腫瘤免疫并加強抗PDL1的功效[8]。益生菌的功能具有種屬特異性和個體差異性，即使屬于同一菌種的不同菌株，也會有功效的差異。例如，假鏈狀雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）CECT 7765能夠有益地調節慢性應激反應[9]，假鏈狀雙歧桿菌IPLA 36007有益于異黃酮活化[10]，而假鏈狀雙歧桿菌G4可以抑制血膽固醇的增加[11]。因此，益生菌菌種乃至菌株的正確使用是益生菌產品發揮功能的最重要的一環。

除了傳統上用于食品生產加工的菌種外，原衛生部辦公廳發布的《可用于食品的菌種名單》和《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》中，列出了7個菌屬共計35個益生菌菌種可用于食品[1217]。市場上的益生菌產品所使用的菌株應當符合國家標準，并且應當標注明確到具體的菌株。目前鑒定益生菌的方法大多限于傳統方法和比較粗放的分子生物學方法，如平板稀釋計數法、顯微鏡測數法、濁度測定法、流式細胞計數法。平板菌落計數法[18]是最經典的細菌計數方法，需要培養活菌，操作簡單、結果穩定，但只能從菌落的形態、顏色等方面初步辨別真菌與細菌。顯微鏡測數法[19]是利用血球計數板，在顯微鏡下計算一定容積里微生物的數量，快速、準確，但不能區分死菌或活菌，不適于對運動細菌的計數，需要較高的細菌濃度，且僅能根據染色后顏色和形態等對細菌做大致的分類。流式細胞計數法[2021]也能夠一定程度上鑒定細菌，但是無法鑒定到種水平。16S rRNA擴增子測序[2223]既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列，但有的菌種由于屬內/種間差異小，單獨依靠16SrDNA鑒定不能鑒定到種水平。Patro等[24]構建了一個名為FDA GutProbe高效可靠的平臺，使用DNA微陣列芯片法鑒定膳食補充劑中微生物成分的存在并確定其差異。但這些常用的方法只是定量測定細胞濃度的方法，無法對微生物進行物種的鑒定，這是傳統方法的局限性。

宏基因組測序[25]可分析特定環境微生物群體基因組成及功能、菌群的多樣性與豐度，可以鑒定出混合環境中包含有哪些菌株，精度可鑒定到菌株水平。Patro等[26]運用宏基因組測序技術鑒定膳食補充劑樣品中微生物活菌，用kmer方法計算其豐度，可快速有效地識別各種膳食補充劑樣品中物種水平，確定這些產品中特定污染物的存在。因此，宏基因組測序技術應用于檢測益生菌產品的菌株組成有其不可替代的優勢。本實驗采用宏基因組測序技術，分析市售10種益生菌產品的菌種組成，為我國益生菌產品的質量監控探索一種新方法。

1材料與方法

11主要試劑與儀器

天根糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司;柏爾快速建庫試劑盒（貨號：514402）;Ampure XP磁珠，Beckman公司;微量核酸定量儀（ND1000 型），美國Nano Drop 公司;PCR 儀（2720 型），美國 Applied Biosystems 公司;電泳儀（PowerpacTM基礎型），美國 BIORAD 公司;凝膠成像系統（Alpha Imager EP通用型），美國 Alpha Innotech 公司;離心機（Z216 MK 型），德國 HERMLE 公司;超聲破碎儀（Bioruptor）;Mini Bead beater16（607EUR型），購于美國BioSpec公司。

12益生菌產品和微生物基因組DNA提取

從京東商城采購10 種市面上常見的益生菌產品，實驗時產品均在保質期范圍內。對于10種產品，均于同一批次內分別隨機抽取2份獨立小包裝，作為實驗重復。使用天根糞便基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取：稱取（200±5） mg益生菌產品干粉至2 mL離心管中，置于冰上。稱取03 g直徑01 mm 的玻璃珠，向樣本中加入14 mL緩沖液GSL，用bead beater 振蕩2 min。用95 ℃、900 r/min振蕩孵育10 min。渦旋15 s。12 000 r/min離心1 min。然后按照天根糞便基因組DNA提取試劑盒的標準流程進行DNA提取。DNA 提取結果用 1% 瓊脂糖凝膠電泳100 V、60 min，通過凝膠成像系統進行檢測。

13微生物DNA濃度檢測

使用Nano Drop核酸濃度測定儀，按照使用說明書，分別取以上益生菌產品提取得到的DNA 洗脫液 1 μL 加樣于檢測區，讀取DNA的濃度。濃度要求不少于10 ng/μL。

14測序文庫的構建及質控

取20 μg微生物宏基因組DNA，使用柏爾快速建庫試劑盒構建測序文庫。具體步驟如下：取檢測合格的20 μg DNA樣品，用Bioruptor儀器隨機打斷成長度約為350 bp的片段，再用磁珠純化，經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫構建完成后，使用Qubit 20進行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測，使用qPCR方法[27]對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>3 mmol/L），以保證文庫上機質量。

15測序

將構建好的文庫在Illumina Hiseq 2500平臺上機進行測序。

16物種注釋

使用MOCAT[28]預處理過濾低質量序列、過短序列以及錯誤序列，得到有效數據。從各樣品質控后的有效數據出發，進行Metagenome組裝[29]。從gene catalogue出發，用bowtie把序列和MicroNR庫進行比對，獲得Unigenes的物種注釋信息，并結合基因豐度表，獲得不同分類層級的物種豐度表。

2結果與分析

21所檢測到的菌株總覽

根據Metagenomic測序生成的進化分支圖，本次檢測的益生菌產品中所測出的菌株，分屬于11個科、11個屬、22個種，其中益生菌集中在2個屬—雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其他益生菌還包括鏈球菌屬（Streptococcus）。腸桿菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬等為產品中痕量的微生物污染。

22所檢測到的菌種與產品說明的對比

在市場上所隨機抽取的10種益生菌產品名稱以字母代號表示。如附圖所示，所檢測的10種益生菌產品中，只有代號為TCBJ和DMKHS的兩個產品的檢測結果和產品標注完全相同，且兩次抽檢檢測到的菌種組成完全一致。其他產品均不達標，表現為缺失產品說明中所列示的菌種，或者含有產品說明中未標示的菌種。10種益生菌產品中，菌種組成的合格率僅為20%。

23分析

市場上的益生菌產品主要包括乳制品、粉劑、片劑等，本次實驗的產品主要是粉劑、片劑、膠囊，近年來這些產品作為補充身體益生菌的主要膳食補充劑而廣受推崇。10種市售的益生菌產品中的菌種大多屬于乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬，其中用的最常見的是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）。本實驗中，通過宏基因組測序檢測出最多的菌種是鼠李糖乳桿菌（Lctobacillus rhamnosus）和動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。總體上，本次檢測的產品存在較為突出的問題，10個產品平均有1～2個標注的益生菌種未檢測到，其中代號為HSYP的產品標注為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），而檢測到的全部為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）;所有產品包裝都沒有標注的菌種玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）在兩個產品中檢測到，且在BSY中為主要益生菌組分;個別產品（代號BSY）益生菌沒有污染的雜菌豐度高，兩次重復測定中益生菌比例僅占285%～32%。部分非產品標注的乳酸菌的出現，可能是由于生產企業為了延長保質期限，將某些可以產生細菌素的乳酸菌如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）等作為食品添加劑導致的[30]。中國目前市場流通的益生菌產品質量良莠不齊，生產企業對微生物的菌種鑒定水平與生產管理水平亟待提高。

3結論

使用宏基因組測序技術對我國益生菌產品質量進行評價發現，益生菌產品市場存在著不規范和安全隱患的問題，可以利用高通量測序的新技術來對國內益生菌產品市場進行監管。益生菌廠家生產時應使用符合國標的具有明確編號的菌株，保證生產、包裝環境無菌，保證消費者的權益。◇

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