核桃低聚肽對輻射小鼠小腸損傷的保護作用

珠娜 劉睿 郝云濤 張亭

摘要：目的：探討核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）對輻射小鼠小腸損傷的保護作用。方法：將96只SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為6組：空白對照組、模型對照組、乳清蛋白組（044g/kg）、3個WOPs組（022、044、088g/kg），再將每組隨機分為2個亞組。連續(xù)飲水干預不同溶液第14天，除空白對照組外所有小鼠全身照射35Gy劑量60Coγ射線，分別在輻射后第3天和第14天采用ELISA法檢測小鼠血清脂多糖（LPS）、二胺氧化酶（DAO）、D乳酸水平，對小鼠十二指腸、空腸和回腸進行HE染色，觀察其損傷情況，并用ImageJ軟件測量絨毛長度和隱窩深度。結果：輻射改變了小腸形態(tài)結構，顯著降低了絨毛長度，增加了隱窩深度及血清LPS、DAO、D乳酸水平（P<005）。與模型對照組相比，預先補充或后期繼續(xù)干預乳清蛋白和WOPs不同程度地改善了輻照小鼠小腸形態(tài)結構。輻射后第3天，與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠小腸各腸段絨毛長度顯著增高（P<005），隱窩深度、血清LPS水平、血清DAO水平及血清D乳酸水平顯著降低（P<005）。輻射后繼續(xù)干預乳清蛋白及WOPs至輻射后第14天，與模型對照組相比，WOPs中、高劑量組小鼠小腸各腸段絨毛長度顯著增加（P<005），隱窩深度、血清LPS水平及血清DAO水平均顯著降低（P<005），血清DAO水平則是WOPs低、中劑量組顯著降低。輻射后第3天和第14天，乳清蛋白組的效果均不顯著。結論：WOPs對輻射小鼠小腸損傷具有良好的保護作用。

關鍵詞：核桃低聚肽;輻射防護;小腸損傷;D乳酸;二胺氧化酶

小腸黏膜屏障，即小腸上皮細胞（IEC）層具有保護無菌微環(huán)境免受物理、化學及生物損害的作用，而小腸上皮的完整性依賴于多能腸干細胞（ISCs）的持續(xù)和可誘導的更新。全身照射或放射治療引起的輻射遺傳毒性效應阻礙ISCs的持續(xù)更新，導致腸上皮損傷，細菌易位，腸道通透性增加，隨后激活機體免疫反應及炎癥反應[15]，而過度的炎癥反應進一步加重小腸黏膜損傷并形成惡性循環(huán)，最終導致營養(yǎng)吸收不良而嚴重影響生活質量[6]，因此，在輻射防護中以腸道為靶點減輕輻射損傷作用具有重要的意義。核桃低聚肽（WOPs）是以核桃蛋白為原料，采用酶解技術提取的分子量小于1 000Da的生物活性肽，已有研究顯示，WOPs具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、免疫調節(jié)、改善學習記憶等一系列生物活性[711]。本研究探討了WOPs對輻射小鼠小腸損傷的保護作用。

1材料與方法

11主要試劑與儀器

WOPs（河南九鼎君健生物醫(yī)藥科技有限公司，分子量小于1 000D）、小鼠脂多糖（LPS）ELISA試劑盒（Andygene）、小鼠二胺氧化酶（DAO）ELISA試劑盒（Andygene）、小鼠D乳酸ELISA試劑盒（Andygene）、Eppendorf 高速冷凍離心機（德國艾本股份公司Eppendorf，德國）、NIKON E400正置熒光顯微鏡（尼康株式會社，日本）、HFY1A 沽源控制臺、HFY601 固定式多路xγ劑量率儀、60Coγ射線輻射源（北京大學化學學院）。

12實驗動物分組與處理

健康SPF級雌性BALB/c小鼠96只，6～8周齡，體重 18～22g。由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）20160010，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）20160041;將小鼠按體重隨機分為6組，每組16只，分別為空白對照組、模型對照組、乳清蛋白組（044g/kg）和3個WOPs組（022、044、088g/kg），將每組再次隨機分為2個亞組。飲水干預不同溶液第14天，除空白對照組外將所有小鼠分別置于單獨的有機玻璃盒（3cm×3cm×11cm）中，一次性全身輻照35 Gy劑量的60Coγ射線，吸收劑量率為1Gy/min，輻射時間為35min。各組小鼠飼養(yǎng)于屏障級動物室，喂飼SPF級生長繁殖飼料，自由飲食和飲水。受試樣品通過飲水攝入，對照組給予蒸餾水，其他各組小鼠分別給予相應濃度的乳清蛋白及WOPs水溶液，不同亞組干預時間不同，給予15～30d。

13指標與方法

131腸道通透性檢測輻照后繼續(xù)給予干預物，并于照射后第3天和第14天，小鼠頸椎脫臼處死，并摘眼球取血，分離血清，用ELISA法檢測血清D乳酸水平。

132腸道屏障檢測輻照后繼續(xù)給予干預物，并于照射后第3天和第14天，小鼠頸椎脫臼處死，并摘眼球取血，分離血清，用ELISA法檢測血清脂多糖（LPS）和二胺氧化酶（DAO）水平。

133小腸組織病理切片輻照后繼續(xù)給予干預物，并于照射后第3天和第14天，每組取4只小鼠頸椎脫臼處死，分別取十二指腸、空腸、回腸固定于10%中性甲醛溶液中，24 h后進行脫水、石蠟包埋、每只小鼠的每個腸段選取4個橫截面進行切片，HE染色，用光學顯微鏡進行腸道病理觀察，并且每只老鼠需選取30個獨立的絨毛和隱窩用ImageJ軟件進行絨毛長度（絨毛連接處到絨毛頂端）和隱窩深度（絨毛連接處到腸腺基部）的測量，最后計算每只老鼠的平均絨毛長度和隱窩深度。

14統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均以±s表示，并采用SPSS 130軟件進行單因素方差分析，采用LSDt檢驗進行兩兩比較，P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果與分析

21WOPs對輻射小鼠小腸形態(tài)結構的影響

由圖1可知，空白對照組小鼠小腸絨毛排列緊密、整齊、有規(guī)則、腸腺完整，內細胞數(shù)目較多，未見有炎癥細胞浸潤。輻射模型組絨毛排列稀疏、不規(guī)整、萎縮、斷裂，見較少殘存腸腺，內細胞變性壞死，可見有炎癥細胞浸潤。乳清蛋白和WOPs干預后不同程度地改善了小鼠的腸道形態(tài)結構，絨毛排列較緊密、整齊、規(guī)則，可見較多的再生腸腺，炎癥細胞浸潤較少。

211WOPs對輻射小鼠小腸絨毛長度的影響輻射后第3天，與空白對照組相比，輻射顯著降低了小鼠小腸各腸段絨毛長度，而WOPs各劑量組小鼠回腸絨毛長度無顯著變化;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠小腸各腸段絨毛長度均顯著增高;與乳清蛋白組相比，WOPs中、高劑量組小鼠十二指腸、空腸和WOPs高劑量組小鼠回腸絨毛長度顯著增高。輻射后第14天，輻射模型組小鼠小腸各腸段絨毛長度仍顯著低于空白對照組;與模型對照組相比，WOPs中、高劑量組小鼠小腸各腸段絨毛長度顯著增高;與乳清蛋白組相比，WOPs中、高劑量組小鼠十二指腸、空腸和WOPs高劑量組小鼠回腸絨毛長度顯著增高（圖2）。

212WOPs對輻射小鼠小腸隱窩深度的影響輻射后第3天，與空白對照組相比，輻射顯著增高了小鼠小腸各腸段隱窩深度，而WOPs各劑量組小鼠小腸各腸段隱窩深度均無顯著變化;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠小腸各腸段隱窩深度及乳清蛋白組小鼠回腸隱窩深度顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs中、高劑量組小鼠十二指腸、空腸隱窩深度及WOPs高劑量組小鼠回腸隱窩深度顯著降低。輻射后第14天，輻射模型組小鼠小腸各腸段隱窩深度及乳清蛋白組小鼠空腸、回腸隱窩深度顯著高于空白對照組;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠十二指腸、回腸隱窩深度及WOPs中、高劑量組小鼠空腸隱窩深度顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs中劑量組小鼠十二指腸隱窩深度及WOPs中、高劑量組小鼠空腸和回腸隱窩深度顯著降低（圖3）。

22WOPs對輻射小鼠血清LPS含量的影響

輻射后第3天，與空白對照組相比，輻射顯著增高了小鼠血清LPS水平，而乳清蛋白組及WOPs干預組小鼠血清D乳酸水平與空白對照組相比均無顯著差異;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清D乳酸水平均顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs中劑量組小鼠血清D乳酸水平顯著降低。輻射后第14天，輻射模型組小鼠血清D乳酸水平顯著高于空白對照組，乳清蛋白組及WOPs干預組小鼠血清D乳酸水平與空白對照組相比無顯著差異;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清D乳酸水平均顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs高劑量組小鼠血清D乳酸水平顯著降低（圖4）。

23WOPs對輻射小鼠血清DAO含量的影響

輻射后第3天，與空白對照組相比，模型對照組和乳清蛋白組小鼠血清DAO含量顯著增高，WOPs各劑量組均無顯著差別;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清DAO水平均顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs各劑量組小鼠血清DAO水平均顯著降低。輻射后第14天，模型對照組小鼠血清DAO水平仍顯著高于空白對照組，而乳清蛋白組及WOPs干預組與模型對照組相比均無顯著差異;與模型對照組相比，WOPs中、高劑量組小鼠血清DAO水平顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs中、高劑量組小鼠血清DAO水平也均顯著降低（圖5）。

24WOPs對輻射小鼠小腸通透性的影響

輻射后第3天，與空白對照組相比，輻射顯著增高了小鼠血清D乳酸水平，而WOPs高劑量組小鼠血清D乳酸水平與空白對照組相比無顯著差異;與模型對照組相比，WOPs各劑量組小鼠血清D乳酸水平均顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs各劑量組小鼠血清D乳酸水平均顯著降低。輻射后第14天，除模型對照組外，其他干預組小鼠血清D乳酸水平與空白對照組相比無顯著差異;與模型對照組相比，WOPs低、中劑量組小鼠血清D乳酸水平顯著降低;與乳清蛋白組相比，WOPs中劑量組小鼠血清D乳酸水平顯著降低（圖6）。

3結論與討論

預先補充或后期繼續(xù)給予WOPs可不同程度地降低小鼠血清D乳酸、LPS、DAO水平，小腸組織病理切片顯示，WOPs干預可改善小腸黏膜損傷情況，不同程度地增高小腸絨毛高度并降低隱窩深度，對輻射小鼠小腸損傷有顯著的保護作用。

電離輻射作用與機體后，通過物理、化學和生物學的復雜機制，繼DNA等大分子損傷后，出現(xiàn)細胞、組織、器官系統(tǒng)乃至整個機體功能代謝和形態(tài)學的輻射損傷，最終導致多器官損傷及功能衰竭[1213]。其中，小腸的輻射損傷導致營養(yǎng)物質及液體吸收減少、電解質失衡、屏障功能喪失、細菌移位、全身細菌感染及膿毒癥等[1417]，在輻射損傷的發(fā)展中起著重要作用。因此，通過抑制輻射對小腸的損傷作用，同時提高受輻射損傷的小腸組織的修復能力不失為一種有效的輻射防護途徑。越來越多的研究顯示，生物活性肽有顯著的輻射防護作用，可通過抑制DNA損傷和細胞凋亡，調節(jié)機體免疫反應、提高機體抗氧化能力來減輕組織的輻射損傷[18]。本研究通過檢測輻射小鼠血清D乳酸、LPS、DAO水平及觀察小腸組織病理損傷情況，測量小腸絨毛長度和隱窩深度來探討WOPs對輻射小鼠小腸損傷的改善情況。為避免單純提高蛋白質的攝入量而引起假陽性結果，本實驗設立了乳清蛋白對照組。

腸黏膜上皮是成年哺乳動物中更新最快的組織，位于隱窩底部的多能ISCs增殖分化為4種主要的上皮細胞，包括絨毛細胞、杯狀細胞、腸內分泌細胞和潘氏細胞，而絨毛尖端的成熟細胞逐漸凋亡。據(jù)研究，小鼠腸粘膜上皮的更新周期為3～5d[1921]。IEC具有很強的輻射敏感性，研究發(fā)現(xiàn)，即使005 Gy的輻射劑量也會檢測到腸道上皮的損傷[22]，是輻射損傷的主要靶細胞之一。本研究發(fā)現(xiàn)，35Gy的60Coγ射線全身輻射導致小鼠小腸絨毛排列不規(guī)則，形狀大小不一，腸絨毛稀疏，萎縮，斷裂，與正常小鼠相比絨毛長度顯著降低，隱窩深度顯著增加（P<005）。WOPs預先補充或后期繼續(xù)干預均不同程度地改善了小腸形態(tài)結構，絨毛排列較整齊，絨毛長度顯著增加，可見較多的再生腸腺，隱窩深度顯著降低，對防治上皮細胞損傷和促進修復具有良好的作用。

急性輻射損傷導致的腸道上皮凋亡、黏膜屏障破壞，最終導致細菌及內毒素易位大量入血，血清LPS含量顯著增加[23]。而內毒素血癥又導致炎癥介質、細胞因子的過量釋放，進一步加重腸黏膜屏障損傷[24]。本研究顯示，35Gy的60Coγ射線全身輻射顯著增加了小鼠血清LPS水平（P<005）。輻射后第3天，預先補充乳清蛋白及WOPs顯著抑制了LPS入血，使血清LPS含量處于正常水平。其中，WOPs各劑量組小鼠血清LPS水平顯著低于模型對照組，WOPs中劑量組顯著低于乳清蛋白組（P<005）。輻射后繼續(xù)給予WOPs至輻射后第14天時，WOPs各劑量組小鼠血清LPS水平仍顯著低于模型對照組，其中，WOPs高劑量組小鼠血清LPS含量顯著低于乳清蛋白組（P<005）?？芍猈OPs預先補充或后期繼續(xù)給予可減輕輻射對小腸黏膜的損傷，提高其損傷修復能力，降低血清LPS水平，避免LPS趨化炎癥因子而加重組織損傷，同時改善輻照小鼠營養(yǎng)狀況。

DAO是一種細胞內酶，主要存在于腸絨毛細胞胞漿中，具有高度活性，而在其他組織含量少，活性低。當腸粘膜細胞受損，黏膜屏障破壞時，DAO釋放入血或隨脫落的腸粘膜細胞進入腸腔內，進而引起血和腸腔DAO活性增高。由于DAO在外周血中活性穩(wěn)定，一般通過檢測DAO在外周血中的變化來反映腸粘膜損傷與修復情況[2527]。本研究顯示，35Gy的60Coγ射線全身輻射顯著增高了小鼠血清DAO含量（P<005）。輻射后第3天，預先補充WOPs顯著降低了輻射小鼠血清DAO含量，WOPs各劑量組小鼠血清DAO水平顯著低于模型對照組和乳清蛋白組（P<005）。輻射后繼續(xù)干預乳清蛋白及WOPs至輻射后第14天時，干預組小鼠血清DAO含量均在正常范圍內，WOPs中、高劑量組小鼠血清DAO水平顯著低于模型對照組及乳清蛋白組（P<005）。上述結果說明WOPs預先補充或后期繼續(xù)干預均可減輕腸粘膜損傷。

輻射產生的大量自由基攻擊腸上皮細胞，導致腸黏膜細胞凋亡，細胞間的緊密連接被破壞，腸道通透性增加。此外，黏膜屏障破壞，細菌易位引起的腸源性內毒素血癥，促使大量細胞因子的釋放，加重黏膜屏障的損傷和腸道通透性的增加[2829]。血清D乳酸水平是反映腸道通透性增加的有效標志物。D乳酸是腸道菌群細菌的代謝產物，而哺乳動物各組織均不產生D乳酸，少量D乳酸經尿液排出。所以，D乳酸基本來源于腸道，其含量與腸道通透性密切相關，所有引起腸道通透性增高的因素均導致血清D乳酸含量增加[3031]。本研究顯示，35Gy的60Coγ射線全身輻射顯著增高了小鼠血清D乳酸水平（P<005）。輻射后第3天，WOPs各劑量組小鼠血清D乳酸水平顯著低于模型對照組及乳清蛋白組（P<005），而與正常對照組相比，WOPs高劑量組小鼠血清D乳酸水平未發(fā)生顯著增加的現(xiàn)象（P>005）。輻射后繼續(xù)干預乳清蛋白及WOPs至輻射后第14天時，干預組小鼠血清D乳酸水平均恢復至正常水平，其中WOPs低、中劑量組顯著低于模型對照組，WOPs中劑量組顯著低于乳清蛋白組（P<005）。輻射小鼠血清D乳酸水平顯著升高是輻射引起腸道通透性增加的重要表現(xiàn)。而預先補充或后期繼續(xù)給予WOPs均不同程度地抑制了其升高，表明WOPs對防治腸上皮細胞損傷和促進上皮細胞修復具有良好的作用。

綜上所述，WOPs可增加輻照小鼠小腸絨毛高度，降低隱窩深度，改善輻照小鼠小腸形態(tài)結構，從而降低血清D乳酸、LPS、DAO水平。WOPs的預先補充即能減輕損傷，而照后繼續(xù)補充有助于提高組織修復能力。WOPs對輻射小鼠小腸損傷的保護作用的機制可能與WOPs抑制腸上皮細胞凋亡、清除自由基、免疫調節(jié)等相關。◇

參考文獻

[1]胡海翔，李光偉電磁輻射對人體的影響及防護[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2015

[2]姜恩海，龔守良，曹永珍電離輻射損傷與臨床診治[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2015

[3]Fischer Julius C，Bscheider Michael，Eisenkolb Gabriel，et al.RIGI/MAVS and STING signaling promote gut integrity during irradiationand immunemediated tissue injury[J].Science Translational Medicine，2017，9（386）：g2513

[4]Peterson L W，Artis DIntestinal epithelial cells：regulators of barrier function and immune homeostasis[J].Nature Reviews Immunology，2014，14（3）：141153

[5]Heidegger S，Mr Van Den Brink，Haas T，et alThe role of patternrecognition receptors in graftversushost disease and graftversusleukemia after allogeneic stem cell transplantation[J].Front Immunol，2014，5：337

[6]Liang Wei，Leibowitz Brian J，Epperly Michael，et alThe GSnitroxide JP4039 improves intestinal barrier and stem cell recovery in irradiated mice[J].Sci Rep，2018，8（1）：2072

[7]劉威，閔偉紅，劉春雷，等核桃清蛋白抗氧化肽的制備及其活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2017（17）：4044

[8]Ma S，Huang D，Zhai M，et alIsolation of a novel biopeptide from walnut residual protein inducing apoptosis and autophagy on cancer cells[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2015，15：413

[9]Miao HThe Research on the impact of maca polypeptide on sport fatigue[J].Open Biomedical Engineering Journal，2015，9（1）：322

[10]崔玲玉長白山核桃蛋白肽的制備及功能活性研究[D].長春：吉林農業(yè)大學，2016

[11]Li W，Zhao T，Zhang J，et alEffect of walnut protein hydrolysate on scopolamineinduced learning and memory deficits in mice[J].Journal of Food Science and Technology，2017，54（10）：31023110

[12]SpotheimMaurizot M，Davídková MRadiation damage to DNA in DNAprotein complexes[J].Mutation Research，2011，711（12）：4148

[13]Lu Xinyue，Nurmemet Dilber，Bolduc David L，et al Radioprotective effects of oral 17dimethylaminoethylamino17demethoxygeldanamycin in mice：bone marrow and small intestine[J].Cell & Bioscience，2013，3（1）：36

[14]Booth C，Tudor G，Tudor J，et alAcute gastrointestinal syndrome in highdose irradiated mice[J].Health Physics，2012，103（4）：383

[15]Naftalin RAlterations in colonic barrier function caused by a low sodium diet or ionizing radiation[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol，2004，23（2）：7997

[16]Dublineau Isabelle，et alIn vivo alterations of fluid and electrolyte fluxes in rat colon by gamma irradiation[J].Digestive Diseases & Sciences，1998，43（3）：652662

[17]Gits J，Gerber G BElectrolyte loss，the main cause of death from the gastrointestinal syndrome？[J].Radiation Research，1973，55（1）：1828

[18]He L X，Wang J B，Sun B，et alSuppression of TNFα and free radicals reduces systematic inflammatory and metabolic disorders：radioprotective effects of ginseng oligopeptides on intestinal barrier function and antioxidant defense[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2017（40）：5361

[19]Barker N，van Es J H，Jaks V，et alVery longterm selfrenewal of small intestine，colon，and hair follicles from cycling Lgr5+ve stem cells[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2008，73（73）：351356

[20]Bjerknes M，Cheng HGastrointestinal stem cells II Intestinal stem cells[J].Current Gastroenterology Reports，2005，12（5）：340348

[21]Barker，Nick，van Nbsp，et alIdentifying the Stem Cell of the Intestinal Crypt：Strategies and Pitfalls[J].Cell Stem Cell，2012，11（4）：452460

[22]Helmrath Michael A，Shin Cathy E，Erwin Christopher R，et alEpidermal growth factor upregulates the expression of its own intestinal receptor after small bowel resection[J].Journal of Pediatric Surgery，1998，33（2）：229234

[23]曹樂電離輻射對小鼠腸道隱窩素4表達的影響及意義[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2015

[24]Kantara Carla，et alNovel regenerative peptide TP508 mitigates radiationinduced gastrointestinal damage by activating stem cells and preserving crypt integrity[J].Laboratory Investigation，2015，95（11）：12221233

[25]張鍔人臍帶間充質干細胞對放射性損傷大鼠腸道自由基及腸細胞調亡的影響[D].衡陽：南華大學，2015

[26]辛勇，周鳳娟，唐天友，等低劑量輻射預處理對小鼠放射性腸黏膜損傷的保護作用[J].山東醫(yī)藥，2011，51（45）：2829

[27]余磊蜂膠總黃酮對大鼠照射導致急性腸黏膜損傷保護作用的實驗研究[D].蘇州：蘇州大學，2011

[28]Lee J S，Tato C M，Joyceshaikh B，et alInterleukin23independent IL17 production regulates intestinal epithelial permeability[J].Immunity，2015，43（4）：727738

[29]Weaver Casey T，et alThe Th17 pathway and inflammatory diseases of the intestines，lungs and skin[J].Annual Review of Pathology，2013，8（1）：477512

[30]李天嬌，張永杰，王子龍，等干酪乳桿菌對不同劑量丙烯酰胺誘導大鼠腸道損傷的保護效果[J].食品科學，2018，39（9）：121126

[31]夏振娜右美托咪啶對熱射病小鼠的保護作用及基于腸道屏障的機制研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2017