阿爾茨海默病外周血中miR-219和CaMKⅡ-γ的表達

唐 恬 趙 宇

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是神經性退行性疾病，其臨床特征為學習能力降低、認知功能障礙、記憶減退及行為異常，嚴重影響患者家庭和生活質量[1]。主要病理特征是突觸變性、神經纖維纏結等，導致神經元丟失。在我國AD患病人群大多在60歲以上，患病率達3.46%～6.41%，且逐年增長[2]。目前關于AD疾病發病機制有很多猜測，包括腦p-淀粉樣蛋白(p-Amyliod，Aβ)級聯學說、神經元凋亡假說、tau蛋白過度磷酸化假說、Ca2+穩態失調假說等。最近研究[3-4]發現，microRNA(miRNA)與神經退行性疾病相關，miR-219在AD患者大腦組織中被下調，參與tau蛋白磷酸化。海馬組織中，miR-219可通過影響鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)參與調控小鼠海馬組織的記憶損傷[5]。據報道[6]，CaMKⅡ可調控蛋白磷酸化級聯反應，從而調節多種基因轉錄，改變神經元興奮，在學習記憶中起重要作用。然而miR-219、CaMKⅡ-γ對AD疾病的影響鮮有文章報道。本文旨在探究AD患者外周血血清miR-219和CaMKⅡ-γ mRNA表達情況，并分析其與AD疾病的相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取四川大學華西醫院門診部2016年2月至2019年2月收治AD患者79例，其中男性49例，女性30例，年齡60～85歲，平均(75.41±7.68)歲。納入標準：AD患者均符合阿爾茨海默病臨床診斷標準[7]。排除標準：①有腦卒中史，有心臟、肝、腎功能和視覺障礙；②患有高血壓、腦血管、糖尿病；③有抑郁癥病史；④有步態不穩，癲癇病、行為異常病史。根據臨床癡呆表(clinical dementia rating scale，CDR)評分[8]將AD患者分為輕度組29例，中度組24例，重度組26例。選擇同期本院健康體檢者79例為對照組，男性44例，女性35例，年齡55～86歲，平均(75.18±8.06)歲，AD組與對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過本院倫理委員會批準，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，且本研究參與者同意簽署知情同意書和臨床研究協議書。

1.2 主要試劑及儀器 白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯免疫吸附(enzyme linked immunos-rbent assay,ELISA)試劑盒(JK-a-0023)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(JK-a-0016)均購自上海晶抗生物工程有限公司；RNA提取試劑盒(R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR?Green Quantitative RT-qPCR Kit(QR0100)購自日本Takara公司；PrimeScript RT reagent Kit(RR047A)購自日本Takara Biotechnology；5427R本德臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；C1000 TouchTMPCR儀、CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；SmartSpec Plus核酸蛋白測定儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集與保存 所有研究對象禁食12 h后，抽取外周血5 mL于EP管中，室溫靜置25 min后，4 ℃，3 500 r/min離心15 min，收集血清，分裝，保存于-80℃備用。

1.3.2 臨床癡呆評分測定 根據CDR評分[8]，測評項目包括記憶力、定向力、解析問題能力、分析問題能力、社會獨立能力、家庭生活幸福指數、智力興趣、自我生活能力等。依據評分結果分為健康(0分)、可疑癡呆(0.5分)、輕度癡呆(1分)、中度癡呆(2分)、重度癡呆(3分)。由同一位臨床經驗豐富的精神科資深醫師測評和匯總。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測外周血血清miR-219、CaMKⅡ-γ的表達 利用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，用核酸蛋白測定儀測量RNA A260/280在1.8～2.0，說明RNA質量良好。采用PrimeScript RT reagent Kit逆轉錄RNA，得到cDNA產物，miR-219、CaMKⅡ-γ引物及內參U6、GAPDH引物采用上海生工合成。采用qRT-PCR測定miR-219、CaMKⅡ-γ水平，利用qRT-PCR儀按照設定程序進行操作。程序設定為參數94 ℃預熱1 min，94 ℃ 35 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共35個循環。總反應體系(20.0 μL)：2×SYBR Green Taq Ready Mix 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。引物由上海生工合成，每例樣本重復操作3次，記錄Ct值，miR-219以U6為內參，CaMKⅡ-γ以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt算法計算miR-219、CaMKⅡ-γ相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 酶聯免疫法檢測外周血血清TNF-α、IL-6的表達 采用IL-6 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒檢測所有研究對象外周血血清IL-6和TNF-α水平，具體操作步驟參考試劑盒說明。

2 結果

2.1 AD組和對照組外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA和miR-219水平比較 與對照組相比，AD組患者血清CaMKⅡ-γ mRNA水平較高(P<0.05)，miR-219水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 AD組和對照組血清CaMKⅡ-γ和miR-219水平比較

2.2 AD組和對照組外周血血清IL-6、TNF-α水平比較 與對照組相比，AD組患者血清IL-6、TNF-α水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 AD組和對照組血清IL-6、TNF-α水平比較

2.3 不同嚴重程度AD患者外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA、miR-219、IL-6、TNF-α水平比較 與輕度組相比，中度組和重度組患者血清CaMKⅡ-γ mRNA、IL-6、TNF-α水平較高(P<0.05)，血清miR-219水平較低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與中度組相比，重度組血清CaMKⅡ-γ mRNA、IL-6、TNF-α水平較高，血清miR-219水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同嚴重程度AD患者血清CaMKⅡ-γ mRNA、miR-219、IL-6、TNF-α水平比較

2.4 AD患者外周血血清miR-219水平與CaMKⅡ-γ水平相關性分析 miRTarBase網站預測，miR-219與CaMK Ⅱ存在結合位點，Pearson分析顯示AD患者外周血血清miR-219水平與CaMKⅡ-γ水平存在明顯相關性(r=-0.710，P<0.05)。見圖1、2。

圖1 miR-219與CaMK Ⅱ結合位點

圖2 AD患者外周血血清miR-219水平與

2.5 AD患者外周血血清miR-219、CaMKⅡ-γ mRNA水平與IL-6、TNF-α水平相關性分析 Pearson分析顯示，AD患者外周血血清miR-219與IL-6、TNF-α呈負相關(P<0.05)，Pearson分析顯示CaMKⅡ-γ與IL-6、TNF-α呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 AD患者血清miR-219、CaMKⅡ-γ mRNA水平與IL-6、TNF-α水平相關性分析(n=79)

3 討論

AD是導致患者認知障礙、運動障礙、記憶障礙的神經退行性疾病[9]，其主要病理特征是β-淀粉樣蛋白沉積形成老年斑，細胞內tau蛋白高度磷酸化導致神經元受損及大腦皮質神經元及突觸衰竭，引起腦皮質動脈血管病變[10]。有研究[11]發現，AD患者血清和腦組織中存在較強炎癥反應，很可能是腦內較強的炎癥反應導致神經組織受損，進而引起細胞死亡。臨床上已發現淀粉樣蛋白誘導AD患者血清和腦組織中血管破裂[12]。

IL-6細胞炎癥因子，可促進氧化應激反應，增加腦組織損害，導致神經細胞消亡；也可以促進β-淀粉樣蛋白沉積，進而影響神經元突觸功能[13]。TNF-α是一種神經毒素，能間接作用于神經元發揮毒性作用。楊姍杉等[14]發現，AD血清和腦脊液中IL-6和TNF-α水平顯著高于對照組，且隨疾病程度加重，IL-6和TNF-α水平逐漸增加。本研究發現，AD患者血清IL-6、TNF-α水平均顯著高于對照組，且不同嚴重程度AD患者血清IL-6、TNF-α水平隨病情增加而增加，重度組患者血清IL-6、TNF-α水平顯著高于中度組和輕度組，中度組患者血清IL-6、TNF-α水平顯著高于輕度組，提示AD發生發展可能與IL-6、TNF-α有密切關系，IL-6、TNF-α可能直接或間接導致神經元細胞凋亡。

miR-219參與調節N-甲基-D-天冬氨酸受體信號通路[5]。CaMKⅡ是多功能蛋白激酶，由12個亞基組成，包括α、β、γ和δ 4種亞單位[15]。Ghosh等[16]發現，CaMKⅡ活性變化及tau蛋白磷酸化與AD患者神經元纖維纏結關系密切，另外細胞內Ca2+穩態失衡可進一步加劇β-淀粉樣蛋白沉積，促進tau蛋白磷酸化，誘導神經元細胞凋亡，導致發生認知功能障礙，加重AD病情。Santamaria等[3]發現，阿爾茨海默氏病患者腦組織中miR-219水平下降，可能與tau蛋白磷酸化相關。余正和等[17]發現，抑郁癥患者外周血白細胞中miR-219水平低于對照組，CaMKII mRNA水平高于對照組。本研究發現，與對照組相比AD血清miR-219明顯降低，CaMKⅡ-γ mRNA水平明顯升高，與輕度組相比，中度組和重度組患者血清CaMKⅡ-γ mRNA水平較高(P<0.05)，miR-219水平較低(P<0.05)，與中度組相比，重度組血清CaMKⅡ-γ mRNA水平上升(P<0.05)，miR-219水平降低(P<0.05)，提示血清miR-219、CaMKⅡ-γ可能參與AD發生發展。與余正和等[17]研究結果一致。Pan等[18]發現，CaMKⅡ-γ是N-甲基-D-天冬氨酸受體信號通路組成部分，miR-219通過靶向CaMKⅡ-γ進而調節N-甲基-D-天冬氨酸受體信號通路介導神經行為功能障礙。本研究發現，miR-219與CaMK Ⅱ存在結合位點，miR-219與CaMKⅡ-γ呈負相關，提示miR-219可能與CaMKⅡ-γ共同影響AD病情。本研究還發現,miR-219水平與IL-6、TNF-α水平呈負相關，CaMKⅡ-γ與IL-6、TNF-α呈正相關，提示miR-219、CaMKⅡ-γ可能通過調節IL-6、TNF-α表達影響AD病情。

綜上所述，AD患者外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA水平上調，miR-219水平下調，與病情嚴重程度有關，可能參與AD發生、發展。本研究由于樣本數量有限，需要進一步加大樣本數量，驗證本研究內容。