MALDI-TOF MS直接靶板微滴生長(zhǎng)法對(duì)耐碳青霉烯類腸桿菌的快速鑒別診斷價(jià)值

沈佳瑾， 黃聲雷， 周春妹， 胡必杰， 郭 瑋*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，上海 200032

細(xì)菌耐藥已成為威脅全球公共衛(wèi)生的一大難題，全國(guó)CHINET數(shù)據(jù)[1]顯示，2005—2018年耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的比例持續(xù)上升，尤其是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率上升幅度超過(guò)8倍，給臨床治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。Idelevich等[2]在2018年首次采用基于MALDI Biotyper系統(tǒng)的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)直接靶板微滴生長(zhǎng)法(direct-on-target microdroplet growth assay，DOT-MGA)快速檢測(cè)美羅培南的耐藥性，該方法快速、通量大，近年來(lái)迅速發(fā)展。本研究首次使用VITEK MS系統(tǒng)，并對(duì)現(xiàn)有DOT-MGA方法做出改進(jìn)，選擇的菌株為CRE中最常見(jiàn)且分離率最高的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，選擇亞胺培南、美羅培南和厄他培南3種臨床常用的碳青霉烯類藥物，評(píng)估DOT-MGA快速鑒別CRE的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室2015—2019年非重復(fù)菌株，大腸埃希菌32株，其中耐碳青霉烯類大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiacoli，CRECO)20株；肺炎克雷伯菌28株，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)16株。

1.2 儀器和試劑 VITEK MS質(zhì)譜儀、VITEK MS-CHCA基質(zhì)液(α-氰基-4-羥基-肉桂酸)及VITEK MS靶板購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。Phoenix ID Broth及PhoenixSpec比濁儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。亞胺培南、美羅培南、厄他培南藥敏試劑及CAMHB肉湯(陽(yáng)離子調(diào)節(jié)MH肉湯)購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司。哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司。

1.3 微量肉湯稀釋法 菌株接種哥倫比亞血瓊脂平板，(35±1)℃孵育18～24 h后備用。挑取新鮮純菌落于Phoenix ID Broth中，采用PhoenixSpec比濁儀調(diào)制0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海⒂肅AMHB肉湯進(jìn)行1∶200稀釋，使菌液終濃度為5×105CFU/mL。將稀釋后的菌液分別接種于亞胺培南、美羅培南和厄他培南藥敏試劑板條(3種藥物濃度范圍均為0.125～256 μg/mL)，(35±1)℃孵育16～20 h后按試劑說(shuō)明書判讀3種藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，結(jié)果解釋參照CLSI 2019年M100文件。用大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853(購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心)作為質(zhì)控菌株。

1.4 DOT-MGA 用新鮮純菌落配制0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙海cCAMHB肉湯1∶100稀釋，使菌液濃度為1×106CFU/mL。用CAMHB肉湯稀釋藥敏試劑板條中的抗菌藥物，靜置30 min使其充分溶解，調(diào)節(jié)藥物濃度至亞胺培南4 μg/mL、美羅培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL。將3 μL菌液和3 μL藥物溶液混合于VITEK MS靶板孔內(nèi)作為檢測(cè)孔，形成終體積為6 μL的微滴，同時(shí)用3 μL菌液和3 μL不加抗菌藥物的CAMHB肉湯混合作為生長(zhǎng)對(duì)照孔。檢測(cè)孔和生長(zhǎng)對(duì)照孔的菌液終濃度為5×105CFU/mL，藥物終濃度為亞胺培南2 μg/mL、美羅培南2 μg/mL、厄他培南1 μg/mL。為防止微滴在孵育過(guò)程中揮發(fā)，需將靶板置于濕盒中，(35±1)℃分別孵育3 h、4 h、5 h和6 h。將生長(zhǎng)對(duì)照孔的成功鑒定率作為生長(zhǎng)對(duì)照有效率，簡(jiǎn)稱有效率。通過(guò)DOT-MGA與微量肉湯稀釋法結(jié)果的比較，計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值4個(gè)指標(biāo)，評(píng)估DOT-MGA 4個(gè)孵育時(shí)間的結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.5 VITEK MS質(zhì)譜鑒定 取出孵育完成的靶板，用移液器每孔吸去5 μL液體，殘留液體用加熱板60℃烘干。按照VITEK MS質(zhì)譜儀標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，將大腸埃希菌ATCC 8739(由法國(guó)生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校準(zhǔn)點(diǎn)位，所有檢測(cè)孔加1 μL VITEK MS-CHCA基質(zhì)液，干燥后上機(jī)獲取蛋白圖譜。比較該圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)(SARAMIS MS-RUO v4.15.0)已知圖譜，經(jīng)軟件(SARAMIS Premium v2.9.3)分析得出最終鑒定結(jié)果。

1.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 軟件評(píng)估鑒定可信度在75.0%～99.9%時(shí)，視為有效的鑒定結(jié)果；鑒定可信度<75.0%時(shí)，無(wú)鑒定結(jié)果。當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照孔成功鑒定到種水平，即鑒定結(jié)果與目標(biāo)菌一致且鑒定可信度在75.0%～99.9%時(shí)，DOT-MGA結(jié)果判定為有效，反之無(wú)效。在結(jié)果有效的條件下，由于微滴中的3種碳青霉烯類藥物濃度為CLSI 2019年M100文件中規(guī)定的中介折點(diǎn)濃度，若檢測(cè)孔成功鑒定到種水平，說(shuō)明細(xì)菌在該濃度的抗菌藥物環(huán)境中生長(zhǎng)，視為耐藥；若檢測(cè)孔無(wú)鑒定結(jié)果，說(shuō)明細(xì)菌在該濃度的抗菌藥物環(huán)境中不生長(zhǎng)，視為不耐藥(敏感或中介)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)比較有效率。采用Kappa檢驗(yàn)評(píng)價(jià)DOT-MGA與微量肉湯稀釋法結(jié)果的一致性。Kappa等于1認(rèn)為兩者完全一致；1>Kappa≥0.75認(rèn)為一致性較好；0.75>Kappa≥0.4認(rèn)為一致性一般；Kappa<0.4認(rèn)為一致性較差。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 菌株MIC值分布 結(jié)果(表1)顯示：微量肉湯稀釋法檢測(cè)所有菌株的亞胺培南、美羅培南和厄他培南的MIC值。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株3種碳青霉烯類藥物的MIC值分布

2.2 肺炎克雷伯菌DOT-MGA檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果(表2)顯示：肺炎克雷伯菌孵育至4 h時(shí)，有效率為92.9%(26/28)，DOT-MGA檢測(cè)3種碳青霉烯類藥物的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100.0%，而有效率在孵育5 h后也達(dá)到100.0%。由于4 h和5 h的有效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.471)，判斷4 h是DOT-MGA鑒別CRKP的最佳孵育時(shí)間。

表2 肺炎克雷伯菌DOT-MGA檢測(cè)結(jié)果 N=28

2.3 大腸埃希菌DOT-MGA檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果(表3)顯示：大腸埃希菌孵育至5 h時(shí)，有效率達(dá)100.0%，DOT-MGA檢測(cè)3種碳青霉烯類藥物的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100.0%，亞胺培南的靈敏度為85.0%(17/20)、陰性預(yù)測(cè)值為80.0%(12/15)；美羅培南的靈敏度為70.0%(14/20)、陰性預(yù)測(cè)值為66.7%(12/18)；厄他培南的靈敏度為95.0%(19/20)、陰性預(yù)測(cè)值為92.3%(12/13)。因其孵育至6 h的結(jié)果準(zhǔn)確性無(wú)進(jìn)一步提升，判斷5 h是用DOT-MGA鑒別CRECO的最佳孵育時(shí)間。

表3 大腸埃希菌DOT-MGA檢測(cè)結(jié)果 N=32

2.4 一致性分析 將2種腸桿菌科細(xì)菌在最佳孵育時(shí)間的DOT-MGA結(jié)果與微量肉湯稀釋法進(jìn)行一致性分析結(jié)果：肺炎克雷伯菌3種碳青霉烯類藥物的DOT-MGA結(jié)果與微量肉湯稀釋法完全一致(Kappa=1)，大腸埃希菌則表現(xiàn)為亞胺培南和厄他培南的一致性較好，且厄他培南(Kappa=0.93)優(yōu)于亞胺培南(Kappa=0.81)，美羅培南一致性一般(Kappa=0.64)。

3 討 論

CRE感染與高死亡率密切相關(guān)，特別是CRE血流感染，其死亡率是非CRE血流感染的2～3倍[3]。快速鑒別CRE有利于臨床早期正確選擇抗菌藥物，降低患者死亡率。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)需16～20 h，耗時(shí)長(zhǎng)；PCR法快速檢測(cè)CRE只能識(shí)別特定、已知的碳青霉烯酶[4]，對(duì)非產(chǎn)碳青霉烯酶機(jī)制或未知碳青霉烯酶導(dǎo)致的耐藥則無(wú)法檢測(cè)，且該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室和人員要求高，儀器價(jià)格昂貴；Carba NP試驗(yàn)同樣只能檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE，且操作復(fù)雜，人為判讀結(jié)果可能會(huì)有誤差。采用MALDI-TOF MS快速鑒別CRE現(xiàn)有3種方法[5]：(1)檢測(cè)菌株與碳青霉烯類藥物作用一段時(shí)間后的水解產(chǎn)物；(2)直接檢測(cè)菌株的碳青霉烯酶質(zhì)譜特征峰；(3)通過(guò)DOT-MGA評(píng)估菌株的MIC值，其中第1種和第3種方法可解決上述問(wèn)題。

本研究選用DOT-MGA，參考Idelevich等[6]得出的最佳微滴體積6 μL，首次采用VITEK MS系統(tǒng)代替MALDI Biotyper系統(tǒng)，并對(duì)現(xiàn)有方法做出了改進(jìn)。其文章中使用特殊材質(zhì)的紙巾通過(guò)毛細(xì)管效應(yīng)去除孵育后靶板上的微滴。由于該材料不易獲得，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)選用普通紙巾替代，但發(fā)現(xiàn)其吸水性不佳且會(huì)引起相鄰孔位的污染。故本實(shí)驗(yàn)采用移液器吸去等量液體再用加熱板烘干的方式，實(shí)驗(yàn)前期嘗試了吸去4.5 μL、5 μL和5.5 μL 3種方案，最終發(fā)現(xiàn)吸去5 μL液體的效果最好。

本研究主要評(píng)估了DOT-MGA在4個(gè)孵育時(shí)間點(diǎn)鑒別CRECO和CRKP的結(jié)果準(zhǔn)確性。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌在孵育3 h時(shí)的有效率為40.6%～67.9%，且DOT-MGA結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差，不推薦作為常規(guī)檢測(cè)方案。大腸埃希菌孵育5 h、肺炎克雷伯菌孵育4 h時(shí)DOT-MGA結(jié)果的準(zhǔn)確性已達(dá)4個(gè)孵育時(shí)間的最高值，延長(zhǎng)孵育至6 h，質(zhì)譜的鑒定可信度雖略有提升，但最終結(jié)果并無(wú)變化。

本研究中的28株肺炎克雷伯菌在孵育4 h時(shí)，僅有2株黏液性菌株生長(zhǎng)對(duì)照孔無(wú)鑒定結(jié)果，其余菌株的DOT-MGA結(jié)果與微量肉湯稀釋法完全吻合，說(shuō)明采用DOT-MGA鑒別CRKP的準(zhǔn)確性高。在大腸埃希菌用此方法檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分CRECO的假陰性，3種碳青霉烯類藥物中厄他培南的準(zhǔn)確性最高。20株CRECO在孵育5 h時(shí)，有3株亞胺培南、6株美羅培南、1株厄他培南的DOT-MGA結(jié)果為不耐藥，但在延長(zhǎng)孵育時(shí)間至18 h后全部耐藥，可能由于某些碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物的速度較慢，且不同碳青霉烯類藥物的作用位點(diǎn)及抗菌活性也有差異[7]，短時(shí)間孵育的菌量尚達(dá)不到質(zhì)譜檢測(cè)的閾值，需要延長(zhǎng)孵育時(shí)間才能得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。本研究的菌株數(shù)量不多，且菌株的MIC值分布不均，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有一定局限性，未來(lái)需加大菌株量來(lái)進(jìn)一步完善。

DOT-MGA具有快速、原理簡(jiǎn)單、操作方便、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用相當(dāng)廣泛，除了鑒別CRE之外，還可檢測(cè)其他菌株類型及其他抗菌藥物的耐藥性。有研究[8]使用該方法篩選耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，或通過(guò)加和不加酶抑制劑的DOT-MGA結(jié)果差異進(jìn)行ESBLs及AmpC酶的檢測(cè)[9]。此外，報(bào)陽(yáng)后的血培養(yǎng)標(biāo)本通過(guò)過(guò)濾、洗滌、離心等前處理，將富集的病原菌直接進(jìn)行DOT-MGA檢測(cè)，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得特定藥物的耐藥性結(jié)果與菌株鑒定結(jié)果[10]。然而DOT-MGA作為一種新方法，其標(biāo)準(zhǔn)化和重復(fù)性有待考察，未來(lái)或許可以通過(guò)引入自動(dòng)化系統(tǒng)或制造商品化藥物凍干粉包被的靶板來(lái)解決這一問(wèn)題[11]。另外，DOT-MGA現(xiàn)仍處在研究的起步階段，仍需繼續(xù)擴(kuò)大菌株類型、增加菌株數(shù)量、探索實(shí)驗(yàn)方案，來(lái)驗(yàn)證現(xiàn)有方法的可靠性和重現(xiàn)性，并繼續(xù)擴(kuò)展其在快速藥敏檢測(cè)領(lǐng)域的運(yùn)用。

綜上所述，采用MALDI-TOF MS的DOT-MGA法鑒別CRE，快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，特別是檢測(cè)CRKP的準(zhǔn)確性高，可為臨床早期的抗菌藥物靶向精準(zhǔn)治療提供幫助。