宏基因二代測序技術對非結核分枝桿菌感染病原學診斷的價值

繆 青， 姚雨濛， 潘 玨， 鮑 容， 王青青， 李 娜， 陳燕瓊， 金文婷， 張 堯， 蘇 逸， 馬玉燕， 黃英男， 胡必杰

復旦大學附屬中山醫院感染病科，上海 200032

隨著經濟和衛生條件的改善及工業化進程的加快，國內感染性疾病譜已發生根本性改變，從病毒性肝炎逐步過渡到以細菌、真菌感染為主的疑難復雜感染癥。非結核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)作為除結核分枝桿菌以外的其他分枝桿菌類型，亞洲人群發病率已增長到約39.6例/十萬人年，并且仍以每年19例/十萬人年的速度增長[1]。在我國，NTM的發病率已逐漸超過結核病。前期臨床數據[2]表明，約47%感染性疾病患者為分枝桿菌感染，而其中NTM約占50%，后者的發病率遠遠超出預期。同時，復旦大學附屬中山醫院NTM的確診率僅為40%左右，據此推測二級醫院及地方醫院的診斷率可能更低。更為嚴峻的是，NTM感染具有用藥方案復雜、療程較長、療效不佳、易復發等特點，成為比結核病更難治療的疾病[3]。因此，精準快速的診斷是改善NTM感染臨床預后的首要條件。

目前NTM感染的主要診斷方法仍為常規微生物培養法，但培養周期較長、培養陽性率低，為臨床診斷帶來挑戰。宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術作為一種新型DNA/RNA測序方法，一方面，較一代測序方法通量更高、測序速度更快；另一方面，通過隨機引物擴增樣本中的所有核酸序列，理論上能無偏倚地檢測出所有潛在病原體。因此，mNGS對于早期診斷疑難感染病例具有重大意義，在臨床中的應用越來越廣泛。本研究通過比較常規微生物培養法和mNGS檢出NTM的陽性率，探討mNGS技術對NTM的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2018年9月至2019年12月復旦大學附屬中山醫院收治的183例疑似NTM感染患者病例資料及388例樣本。納入標準：臨床特征符合NTM診斷；樣本質量合格；檢測質控合格。排除標準：患者拒絕送檢相關體液樣本；樣本質量不合格；同期樣本未送檢傳統病原學檢查或病理檢測；測序結果示質控不達標。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(No.B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 常規微生物學培養 桿菌培養采用BACTEC MGIT960系統、改良羅氏法; 結核分枝桿菌復合菌與NTM分群主要采用對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗, 輔以耐熱觸酶試驗、28?生長實驗。

1.3 mNGS檢測

1.3.1 樣本處理和DNA提取 取0.5～3 mL患者痰液，經玻璃珠混合震蕩后按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316，天根生化科技有限公司，中國)試劑盒步驟提取DNA。

1.3.2 文庫構建和測序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher，美國)對DNA文庫濃度進行質控分析，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制(RCA)生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載到測序芯片,使用BGISEQ-500進行測序。

1.3.3 數據分析 測序數據下機后去除低質量和長度小于35 bp的數據以獲得高質量數據，通過比對，將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除。去除低復雜度序列后與微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲進行分類排列。

1.3.4 mNGS陽性標準 解讀標準參照既往研究成果[2]，通過覆蓋度比例及排名界定陽性報告。灌洗液中，NTM屬排名為前40以內，痰樣本為前60，組織樣本為前10。

2 結 果

2.1 一般資料 結果(表1)顯示：183例NTM感染患者，共388例樣本。其中男性92例，女性91例，平均年齡55歲。感染病科送檢149例，占81.4%，其余送檢科室分別為重癥監護室、風濕科、呼吸科等。收治患者中，感染性疾病確診患者為133例，占72.7%；在感染性疾病中，101例為肺部感染，占76.5%；感染性疾病的病原學確診病例數為81例，占61.8%。

表1 183例NTM感染患者一般資料分析

續表

2.2 樣本總體陽性率及檢測時間比較 結果(圖1)顯示：388例樣本中，通過常規培養法檢測出NTM陽性為85例，占總例數的21.9%；mNGS檢測NTM陽性為96例，占總例數的24.7%。2種方法總體陽性率差異無統計學意義(P=0.29)。96例mNGS陽性樣本的檢測周期為48 h，85例培養法陽性樣本的平均檢測周期為28 d，mNGS檢測周期明顯較短。

圖1 常規培養法與mNGS總體陽性率比較

2.3 不同樣本類型檢測陽性率比較 結果(圖2A)顯示：388例樣本中，各樣本類型分布如下：組織90例，痰83例，肺泡灌洗液81例，血液64例，體液42例，其他28例。對于組織樣本，培養法的陽性率明顯低于mNGS檢測法(7.8%vs27.8%，P<0.000 1)；對于痰液樣本，培養法的陽性率明顯高于mNGS檢測法(56.6%vs22.9%，P<0.000 1)；而肺泡灌洗液，培養法和mNGS檢測陽性率差異無統計學意義(30.9%vs40.7%)。

2.4 臨床獲益比較 結果(圖2)顯示：3個月的隨訪結果表明，mNGS 3個月內抗菌藥物調整頻率低于培養方法，差異有統計學意義(20.3%vs40.2%，P<0.05)；患者抗NTM治療有效率與培養法差異無統計學意義(40.7%vs50.2%)。

圖2 mNGS與常規培養方法的臨床獲益比較

3 討 論

近年來，mNGS技術在感染病原學領域的應用價值受到了越來越多的關注和認可，宏基因測序由于其隨機引物進行無差別的擴增，比傳統檢測方法具有更高的敏感性，是病原檢測領域一項突破性的技術。目前，國內外針對此技術的臨床應用已有初步成果[4-7]，包括病例報道、病例系列報道、大樣本研究等，涉及骨關節感染、皮膚軟組織感染、肺部感染、中樞神經系統感染等，研究結果均表明，mNGS對病原體的檢出效能較傳統檢測方法優勢明顯。因此，將來mNGS可能顛覆傳統病原體檢測流程，成為主導性診斷方法。目前研究重點需轉移到此技術的改進流程及相關科研成果。

但是，前期研究[1]表明，mNGS在分枝桿菌的檢測效能方面具有明顯不足，而且非結核分枝桿菌mNGS的檢出率和傳統方法相比無明顯優勢。針對此現象，本研究采用2種方法檢測NTM病例樣本，結果表明，NTM和傳統培養法陽性率均不足50%，總體靈敏度較低。可能是送檢樣本如血液、拭子等本身的檢測陽性率就極低，因此總體陽性率偏低。基于上述結果，本研究認為NTM的病原學診斷依舊是臨床實踐中的難點，即使有了mNGS方法的應用，NTM的陽性率并沒有明顯提高，mNGS技術未來需要針對此病原體作重點改進。

另外，盡管mNGS和培養法在NTM病原體檢出方面差異無統計學意義，但是將各類樣本進行分層分析的結果表明，2種方法對肺泡灌洗液、痰液、組織這3種樣本的檢出陽性率差異明顯。其中，痰液采用培養法檢測的陽性率較高，而mNGS在肺泡灌洗液及組織檢測中的陽性率較高。此結果與前期研究[1]相呼應，即mNGS檢測NTM的理想樣本為肺泡灌洗液和組織，而痰液樣本可能由于大量口腔定植菌占絕大比例，間接導致NTM的序列檢出數量明顯下降，從而降低mNGS的靈敏度。

本研究結果表明，目前mNGS在鑒定診斷NTM這種病原體方面，與傳統培養相比較，靈敏度無明顯優勢。但是在2種檢測方法陽性率相當的情況下，mNGS能在24 h內明確NTM及菌種，而傳統培養方法最長45 d報陽，菌種鑒定則更久。因此，本研究關于臨床獲益的統計表明，mNGS診斷為NTM的患者，3個月內抗生素調整頻率低于培養組。另外，雖然2組患者的抗NTM時間及3個月內病灶好轉率無明顯差異，本研究認為造成此陰性結果的原因是本研究團隊對NTM的影像學及臨床特征認識比較深入，漏診率低，診治大多較及時，因此，后期可招募其他醫院及中心的患者，更加客觀評估mNGS的臨床獲益。

如何改進mNGS技術，提高NTM的檢測陽性率？目前認為，增加數據量可增加mNGS的靈敏度，目前的數據量為每個樣本30 M序列數，如果測序深度加大到100 M時，可能會使靈敏度趨于100%。但是，加大深度會帶來另一個問題：如何判讀所測到目標序列的真陽性或假陽性，在增加靈敏度的同時，是否會降低特異度？這是該技術未來需要探索的問題。

在現階段的技術水平情況下，本研究認為對于疑似NTM感染患者，如果經濟條件許可，推薦送檢mNGS，在快速明確診斷并獲得菌種信息的同時，揭示可能的合并感染。另外，對于肺部NTM感染擬診患者，推薦的樣本送檢優先級別分別為肺泡灌洗液>肺組織>痰液，送檢痰液時盡量送檢深部晨痰以提高陽性率。

本研究尚有不足之處，病例未進行NTM的PCR檢測，目前NTM的核酸檢測相對成熟，因此可以和培養法相互補充，提高檢測陽性率。因此，如果改進傳統方法檢測流程，可使入組患者例數增多，研究結果及數據更具客觀性。

綜上所述，mNGS是一項具有前景的研究，但是在NTM的病原學檢測領域尚有很多不足，需重點改進以促進此技術更好地應用于臨床。