宏基因二代測序技術(shù)對慢性肺曲霉病病原學(xué)診斷的價(jià)值

張 堯， 繆 青， 金文婷， 史慶豐， 蘇 逸， 馬玉燕， 王青青， 潘 玨， 胡必杰,*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，上海 200032

曲霉菌在自然界中分布廣泛，人類往往通過吸入曲霉分生孢子引起感染。由于宿主免疫狀態(tài)不同，曲霉菌可引起各種臨床綜合征，包括侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis, CPA)和過敏性疾病等[1]。近年來，由于器官移植患者的增加、艾滋病患病率的快速增長和廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和抗腫瘤藥物的大量使用，肺曲霉病的發(fā)病率和死亡率有增高趨勢[2]。因此，早期識別和診斷此類疾病對改善預(yù)后具有重要意義。常規(guī)的CPA診斷主要通過從肺組織活檢樣本中檢出曲霉孢子或菌絲作為確診依據(jù)，或根據(jù)痰液、BALF等呼吸道樣本的真菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行診斷，但組織活檢和真菌培養(yǎng)對檢出肺曲霉病能力有限，且耗時較長[3]。

宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術(shù)作為一種新型的基因檢測技術(shù)，理論上可快速、無偏倚地檢測樣本中所有病原體，包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等，特別適用于罕見的、新現(xiàn)的和非典型的病原體[4-6]。研究[7-8]表明，mNGS在病原體的早期診斷方面具有較高的敏感性，并且不受抗感染藥物的影響，是感染性疾病可靠的檢測手段。本研究回顧性分析2017年9月至2019年9月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科收治的78例疑似慢性肺曲霉病患者，采集樣本進(jìn)行mNGS、煙曲霉特異性抗體IgG檢測和常規(guī)微生物培養(yǎng)，根據(jù)最終確診結(jié)果評估m(xù)NGS在CPA診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2017年9月至2019年9月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科住院的78例疑似慢性肺曲霉病患者，同步采集樣本進(jìn)行常規(guī)微生物培養(yǎng)、血清煙曲霉特異性抗體IgG檢測和mNGS，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診后分為CPA組(35例)和非CPA組(43例)。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(No.B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 CPA的診斷標(biāo)準(zhǔn) CPA的診斷包括確診和臨床診斷，確診標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)歐洲臨床微生物與感染性疾病學(xué)會和歐洲呼吸學(xué)會發(fā)布的慢性肺曲霉病的診斷和管理指南[9]以及美國感染病學(xué)會定義的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，同時滿足以下條件。

(1)慢性肺部癥狀、慢性肺病或進(jìn)展性影像學(xué)異常，如空洞、空洞周圍浸潤及真菌球；

(2)沒有或輕度的免疫功能損害，通常有一個或多個基礎(chǔ)肺疾病；

(3)曲霉IgG抗體升高或其他微生物學(xué)證據(jù)(如痰液、BALF或肺組織曲霉培養(yǎng)陽性、血清GM試驗(yàn)陽性、組織病理學(xué)見霉菌樣菌絲)。

臨床診斷指滿足診斷標(biāo)準(zhǔn)中的第1條和第2條，但無曲霉感染的血清學(xué)、微生物學(xué)或病理學(xué)證據(jù)，臨床醫(yī)生在排除其他疾病后做出診斷，并且抗曲霉治療后患者癥狀有好轉(zhuǎn)。

1.3 常規(guī)微生物培養(yǎng)法 將收集到的痰樣本按照微生物接種方法接種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基，將BALF樣本接種于沙保氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置于25℃和35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d，每天對菌落的形態(tài)和生長情況進(jìn)行肉眼觀察。

1.4 血清煙曲霉特異性抗體IgG檢測 采用酶聯(lián)免疫法測定煙曲霉特異性抗體IgG，將稀釋后的患者血清樣本加到包被曲霉半乳甘露聚糖的酶標(biāo)板中，血清中的曲霉IgG便與抗原結(jié)合，再加入抗人IgG酶標(biāo)抗體和四甲基聯(lián)苯胺產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的曲霉IgG抗體濃度。煙曲霉特異性抗體IgG≥120 AU/mL，定義為陽性。

1.5 mNGS檢測

1.5.1 樣本處理和DNA提取 取0.6 mL呼吸道樣本(痰液、BALF、肺組織勻漿)，經(jīng)玻璃珠混合震蕩后使用TIANamp Micro DNA Kit (DP316, 天根生化科技有限公司，中國)試劑盒提取DNA。提取的DNA用作DNA文庫構(gòu)建。

1.5.2 文庫構(gòu)建和測序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，美國)質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制(RCA)生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載到測序芯片，采用BGISEQ-500進(jìn)行測序。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量的和長度小于35 bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除，剩下的數(shù)據(jù)去除低復(fù)雜度reads后與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類和排列。

1.5.4 mNGS曲霉陽性定義 以屬嚴(yán)格序列數(shù)(SMRNG)或種嚴(yán)格序列數(shù)(SMRN)≥2為陽性界定值。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 結(jié)果(表1)顯示：2組患者年齡、性別和mNGS樣本類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。送檢的78例樣本中，痰樣本55例、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)樣本17例、肺組織樣本6例。35例CPA患者中，28例有基礎(chǔ)疾病，其中，有肺結(jié)核史9例、有COPD和支氣管擴(kuò)張癥9例、有近期糖皮質(zhì)激素治療史6例、有實(shí)體器官腫瘤4例、有非結(jié)核分枝桿菌感染史2例。

表1 78例疑似CPA患者一般資料分析

2.2 靈敏度和特異度比較 結(jié)果(表2)顯示：以最終臨床診斷(包括確診和臨床診斷)為金標(biāo)準(zhǔn)，mNGS的靈敏度和特異度分別為65.7%和86.0%，靈敏度高于煙曲霉特異性抗體IgG檢測和常規(guī)微生物培養(yǎng)法，并且與常規(guī)培養(yǎng)法之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

表2 不同檢測方法診斷CPA的靈敏度和特異度

在CPA組中，僅通過臨床診斷確診的CPA患者有8 例，其中4例(50.0%)患者mNGS結(jié)果陽性。培養(yǎng)陰性的CPA患者有25例，其中有14例(56.0%)患者mNGS陽性，12例患者煙曲霉特異性抗體IgG陽性。

2.3 診斷價(jià)值比較 結(jié)果(圖1)顯示： mNGS、煙曲霉特異性抗體IgG檢測和常規(guī)微生物培養(yǎng)法的ROC曲線下面積(area under curve, AUC)分別為0.759、0.696和0.608，提示mNGS對診斷CPA的診斷價(jià)值更高。

圖1 3種檢測方法的ROC曲線

2.4 不同樣本類型中mNGS結(jié)果比較 35例CPA患者樣本中，痰樣本、BALF樣本和肺組織樣本的mNGS陽性率分別為56.5%(13/23)、77.8%(7/9)和100%(3/3)，BALF的mNGS陽性率最高，但3種樣本間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.341)。

3 討 論

CPA在全球范圍廣泛分布，其發(fā)病率逐年上升[11]。目前診斷CPA主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征和提示曲霉感染的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果綜合判斷，診斷非常困難[10]。本研究結(jié)果提示，對于診斷CPA，mNGS、煙曲霉特異性抗體IgG檢測和常規(guī)培養(yǎng)的靈敏度分別為65.7%、48.6%和28.6%，mNGS的靈敏度最高，mNGS法優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法。Miao等[7]關(guān)于mNGS的回顧性研究表明，mNGS對診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，特別是在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、病毒、真菌和厭氧菌病原體中，mNGS的陽性率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)，并且檢測結(jié)果不受早期抗菌藥物暴露的影響。Li等[8]對mNGS檢測肺組織感染性病原體的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)培養(yǎng)相比，mNGS具有檢測時間短、靈敏度高的特點(diǎn)，可無偏倚地檢測出苛養(yǎng)菌及厭氧病原體，其檢測細(xì)菌的靈敏度和特異度分別為100%和76.5%，檢測真菌的靈敏度和特異度分別為57.1%和67.5%。與本研究結(jié)果一致。mNGS檢測方法的AUC高于煙曲霉特異性抗體IgG和常規(guī)培養(yǎng)，進(jìn)一步說明mNGS對CPA診斷價(jià)值最高。

Miao等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在非結(jié)核分枝桿菌感染患者中，BALF樣本中mNGS檢測的陽性率高于痰樣本，但在結(jié)核分枝桿菌、曲霉和隱球菌感染的患者中，痰樣本、BALF樣本和組織樣本間的mNGS陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，痰樣本、BALF樣本和肺組織樣本的mNGS陽性率分別為56.5%、77.8%和100%，但三者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)果一致。

煙曲霉特異性抗體IgG檢測是機(jī)體對曲霉菌感染后出現(xiàn)的特異性免疫反應(yīng)，檢測患者血清中特異性IgG抗體可確定患者機(jī)體免疫狀態(tài)，從而對肺曲霉病的臨床診斷具有重要意義。IDSA指南也將煙曲霉特異性抗體IgG列為CPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。研究[12-13]表明，煙曲霉特異性抗體IgG檢測診斷CPA的靈敏度可達(dá)75%～98%。但在本研究中，煙曲霉特異性抗體IgG的靈敏度僅為48.6%，可能與不同的研究中判斷閾值不同及檢測方法有關(guān)。而mNGS的靈敏度明顯高于煙曲霉特異性抗體IgG檢測法，二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)。

真菌培養(yǎng)是診斷CPA的基本檢測方法，根據(jù)不同的研究[13]報(bào)道，CPA患者的呼吸道樣本真菌培養(yǎng)陽性率為11.8%～81.0%，同時由于曲霉可在氣道定植，因此可造成一定的假陽性。本研究中，呼吸道樣本培養(yǎng)診斷CPA的靈敏度僅為28.6%，顯著低于mNGS。常規(guī)微生物培養(yǎng)和鑒定依賴于活的微生物的生長倍增速度，對于常見的細(xì)菌性病原體往往至少需要48 h，對于真菌至少需要7 d[14]。而mNGS可在采集樣本后24～36 h內(nèi)出具檢測結(jié)果，大大縮短了檢測時間，為感染性疾病特別是重癥和疑難感染的診斷和治療爭取了時間。

本研究存在一些不足之處：(1)本研究為回顧性研究且納入的病例數(shù)較少，因此關(guān)于mNGS在CPA中的診斷價(jià)值需要更大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)；(2)由于GM試驗(yàn)對診斷CPA的靈敏度和特異度都較低[13]，本研究中的CPA患者GM陽性率僅為14.3%，且GM試驗(yàn)多用于侵襲性肺曲霉病的診斷，故未分析GM試驗(yàn)的靈敏度和特異度。

綜上所述，在CPA的診斷中，mNGS的靈敏度顯著高于常規(guī)培養(yǎng)法和煙曲霉特異性抗體IgG檢測法，且在檢測時間上優(yōu)勢明顯。