宏基因二代測序技術對脊柱感染病原學診斷的價值

金文婷， 李 娜， 周曉崗， 張 堯， 黃英男， 蘇 逸， 姚雨濛， 繆 青， 馬玉燕， 李 冰， 王青青， 王萌冉， 駱 煜， 蔡思詩， 潘 玨， 胡必杰

復旦大學附屬中山醫院感染病科，上海 200032

脊柱感染包括脊椎骨髓炎、椎間盤炎和硬膜外膿腫，常由遠處病灶血行播散至一個或多個椎體引起[1]。感染可累及鄰近椎間隙，也可在手術[2]或椎間隙注射后發生，或從鄰近軟組織鄰接播散而來。脊柱感染是引起腰背痛的潛在原因之一，雖然臨床發病率不高，但一旦發生，如不及時和恰當治療，將造成破壞性的損害。

導致脊柱感染最常見的病原體為金黃色葡萄球菌，其他病原體包括大腸埃希菌、念珠菌、鏈球菌、結核分枝桿菌、布魯菌等[3]。目前脊柱感染病原體的檢測方法主要基于病史聯合血培養或血清學檢測結果，但陽性率普遍較低，不利于疾病的早診早治。宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術是新興的病原體檢測手段，已被廣泛應用于血液[4-5]、呼吸道標本[6-7]、腦脊液[8-9]、人工關節標本[10-11]等多種標本的檢測，取得了顯著成效，但目前缺乏其在脊柱感染病原學診斷中的應用分析。因此，本研究以疑似脊柱感染患者為研究對象，采用常規微生物培養法和mNGS技術檢測脊柱感染組織標本，對比診斷效能，探討mNGS對脊柱感染病原學診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月至2019年12月復旦大學附屬中山醫院收治的疑似脊柱感染患者，共24例。納入標準：年齡大于14周歲；臨床懷疑脊柱感染；進行CT引導下脊柱病灶穿刺或脊柱手術；留取穿刺或手術組織；病理排除腫瘤性疾病；骨組織勻漿行mNGS檢測及常規微生物培養。排除標準：穿刺或手術組織勻漿太少僅行常規微生物培養，未送組織行mNGS。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審核批準(No. B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 常規微生物學培養 研磨穿刺組織標本成組織勻漿，分別接種于血瓊脂平板、巧克力平板行細菌培養，接種于念珠菌顯色平板、沙式葡萄糖瓊脂培養基(SDA)平板行真菌培養，分枝桿菌培養系統(MGIT960)進行分枝桿菌培養。

1.3 mNGS

1.3.1 樣本處理及DNA提取 穿刺組織標本經研磨成組織勻漿，取0.6～0.7 mL勻漿，經玻璃珠混合震蕩后按照TIANamp DNA提取試劑盒(DP316, 天根生化科技有限公司，中國)步驟提取DNA。

1.3.2 文庫構建和測序 采用Agilent2100生物分析儀(Agilent，美國)質控文庫插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒(Thermo Fisher，美國)質控DNA文庫濃度，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNA納米球(DNA nanoball，DNB)。制備好的DNB加載到測序芯片，采用BGISEQ-50高通量臺式測序系統(深圳華大基因科技有限公司，中國)進行測序。

1.3.3 數據分析 測序數據下機后去除低質量的和長度小于35 bp的數據以獲得高質量的數據。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將高質量數據中比對人參考基因組序列的數據去除。剩余數據在去除低復雜度序列后與專用的微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類和排列。

1.4 mNGS陽性標準 細菌：種水平覆蓋度為其他任何微生物10倍以上(結核分枝桿菌復合群嚴格比對序列數至少1條)；真菌：種水平覆蓋度為其他真菌5倍以上；病毒：種水平覆蓋度為其他病毒5倍以上。

2 結 果

2.1 一般資料分析 疑似脊柱感染患者共24例，男性17例，女性7例；年齡14～78歲，平均年齡為(54.0±19.0)歲，紅細胞沉降(56.2±19.6)mm/h, C-反應蛋白(46.7±62.5)mg/L。

2.2 陽性率比較 結果(圖1A)顯示：共24例樣本，mNGS陽性結果17例，符合臨床診斷的結果15例，2例不確定，符合臨床診斷的陽性率62.5%(15/24)。4例因穿刺標本有限，僅送mNGS檢測，未送常規微生物培養。常規微生物培養7例陽性結果，陽性率為35.0%(7/20)。

2.3 檢測時間比較 結果(圖1B)顯示：mNGS平均檢測時間為36～48 h，明顯低于常規培養的檢出平均時間21.8 d。

2.4 病例檢測結果與臨床診斷符合情況 結果(圖2)顯示：符合臨床診斷的15例患者中結核分枝桿菌6例，金黃色葡萄球菌5例，大腸埃希菌2例，馬爾尼菲藍狀菌1例，諾卡菌1例。常規培養陽性共7例，其中6例與mNGS結果一致，1例培養結果為野油黃單胞菌(考慮污染可能性大)。

圖1 常規微生物培養法和mNGS的陽性率(A)和檢測時間(B)比較

圖2 24例病例樣本檢測結果與臨床診斷符合情況

2.4 典型病例簡介 在常規微生物培養結果陰性情況下，mNGS額外檢出9例符合臨床意義的病原體，其中結核分枝桿菌4例，金黃色葡萄球菌3例，大腸埃希菌1例，諾卡菌1例。現將其中3例典型病例報告如下。

2.4.1 典型病例PT6 男性，61歲，11個月前確診肺結核，至今仍處于治療中。9個月前開始胸背痛，胸椎MRI平掃(圖3A)示T9椎體楔形變，T8-9椎體信號異常，T2抑脂高信號，T1WI呈低信號，臨近軟組織稍腫脹，信號高。CT引導下穿刺未見肉芽腫及凝固性壞死，抗酸染色陰性；胸部CT(圖3A)示右肺上葉結節病灶伴纖維條索影。入院前胸椎MRI平掃(圖3B)示T9椎體明顯楔形變，T8-9椎體信號異常，T2抑脂呈高信號，T1WI呈低信號，鄰近軟組織腫脹、信號增高，T8-9椎間盤內見斑片狀長T2WI信號影，椎體邊緣見骨質增生征象。抗結核過程中，脊柱病灶逐漸增大并出現壓迫癥狀，曾穿刺培養，但無結核證據。脊柱穿刺組織液的細菌、真菌、分枝桿菌培養結果均為陰性，脊柱組織經mNGS檢出結核分枝桿菌復合群2條。

2.4.2 典型病例PT20 男性，15歲，腰痛2月就診，炎癥標志物升高不明顯，結核菌感染T細胞斑點試驗(T-SPOT)結果為陰性。腰椎病灶穿刺病理僅提示慢性炎癥伴纖維組織增生。腰椎MRI(圖4A)示L3下緣、L4椎體上緣骨質破壞，伴局部骨質硬化，腰L3-4椎間隙變窄，鄰近腰大肌未見明顯腫大及異常強化灶。該患者影像學不排除結核但依據不足，外院仍建議抗結核治療，且用藥后消化道副反應明顯。穿刺組織mNGS檢出諾卡菌屬，為該患者提供了重要的病原學依據，抗諾卡菌治療后復查MRI(圖4B)明顯好轉。

圖3 PT6脊柱結核合并肺結核影像學資料

圖4 PT20諾卡菌脊柱感染治療前后腰椎MRI圖像

2.4.3 典型病例PT24 男性，68歲，因發熱待查收治入院，外院曾血培養示大腸埃希菌。入院后炎癥標志物升高，多次血培養結果均陰性，血mNGS檢出大腸埃希菌序列。因無法確定脊柱病灶是否可用大腸埃希菌血流感染一元論解釋，行CT引導下胸椎病灶穿刺，病理結果示：部分為骨組織，骨組織中骨小梁間可見增生纖維組織、骨髓造血組織，其部分區可見大量中性粒細胞及嗜酸粒細胞浸潤，傾向急性炎癥。PET/CT(圖5A、5B)示L3椎體及L4椎體后部見溶骨性骨質破壞伴糖代謝異常增高，最大標準攝取值(SUV值)分別約為15.2和14.4；腰椎MRI(圖5C)示L3信號異常，T1WI呈稍低信號，T2WI呈不均勻稍高信號，顯著強化，L4椎體見可疑類似信號，椎管前緣局部強化。骨組織mNGS檢出大量大腸埃希菌序列(種嚴格序列數8 116條)。

圖5 PT24大腸埃希菌脊柱感染腰椎PET/CT及MRI圖像

3 討 論

脊柱感染發病率低，感染病科、骨科及影像科醫生很難將其與非感染性疾病區分，且很難鑒別感染病原體，更多會經驗性抗感染治療。mNGS是一種非培養技術，能夠快速全面地檢測病原體，之前研究[12]結果也顯示，mNGS具有更高的病原體鑒定靈敏度，且受抗生素暴露影響小。

對于難以診斷的脊柱感染病例，診斷性穿刺活檢是確診并鑒別診斷的最佳方案。但有研究[13]顯示，經CT引導下穿刺的陽性率為47%～100%。但若穿刺前接受過抗感染治療，活檢微生物結果可能會出現假陰性。本研究結果也顯示，組織病理診斷缺乏特異性，對結核、真菌等感染部分可有肉芽腫改變、抗酸染色或過碘酸希夫染色(PAS)、六胺銀染色陽性的結果，但對于細菌性感染組織學可能并無特異性改變，只表現為炎癥細胞浸潤或膿腫形成。

本研究結果顯示，mNGS的總體陽性率高于常規培養(62.5%vs30.0%)，檢出病原體主要為結核分枝桿菌，骨結核在肺外結核中發病率約為10%[14]。本研究檢出率高可能與中國結核患者基數大及本病區收治病種有關。其次為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，細菌性病原體的檢出情況與既往文獻報道[2]相符。分枝桿菌及其他細菌的mNGS檢出率都高于常規培養，且檢測時間上存在明顯優勢，36～48 h即可取得結果，而分枝桿菌培養、真菌培養通常耗時較長，陽性率低，故mNGS在檢出陽性率及檢出時間上均有優勢。以往研究[15]顯示，對于培養陽性率低或培養時間長的病原體，mNGS檢測具有優勢，與本研究結論一致。圖2中mNGS與臨床診斷情況相符的患者中，在疾病診治早期，mNGS為治療方案的決策提供了非常重要的依據。

mNGS因其具有無靶病原檢測的特性，理論上可檢測樣本中所有微生物信息，可能檢出多種病原體，也可能出現檢出多種病原體但無法確定致病病原體或無法確定是否與臨床相符的情況[16]。例如PT3脊柱骨折術后發熱患者，mNGS檢出大量人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、丙酸痤瘡桿菌和少量非結核分枝桿菌，此時還需要結合臨床資料及有經驗的感染病科醫生來綜合決策。本研究中有3例結核病例出現假陰性的情況，可能與結核分枝桿菌為胞內菌，目前破壁技術局限有關。

綜上所述，mNGS能夠快速檢測脊柱感染病原體，為臨床早期精準治療提供重要的病原學依據。