Radil在肝癌組織中的表達及對肝癌發展的影響

孫海香， 史穎弘， 樊 嘉,， 楊柳曉*

1. 復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院肝外科，上海 200032

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌發病率列惡性腫瘤第4位，死亡率占據第2位，對人類的健康造成嚴重威脅，因此深入探索分析肝癌的發病、發展機制對于肝癌治療具有非常重要的指導意義[1]。Radil(Ras association and DIL domains)是小G分子Rap的效應分子，研究發現其對細胞的黏附、運動起著重要的作用，但對其在肝癌組織中的表達及其意義研究較少。本研究旨在通過免疫組化及蛋白質印跡(Western blot，WB)方法分析肝癌組織標本中Radil的表達水平，通過過表達或敲低Radil表達水平分析其對肝癌細胞生長及運動的影響，探討其對肝癌發展的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系 肝癌細胞Hep3B、Huh7購自中科院上海生化細胞所， MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3細胞株由復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所提供。所有肝癌細胞系均用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液于5% CO2，37℃下進行培養。細胞生長至90%融合度用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代。Radil過表達和敲低病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 臨床標本 選取復旦大學附屬中山醫院肝外科手術切除的肝癌標本，癌旁標本作為對照，并經液氮速凍后立即置入-80℃冰箱中保存。組織標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片，切片厚度4 μm，備染。

1.3 免疫組化 石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，微波修復抗原，漂洗后置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。5% H2O2室溫孵育30 min，血清封閉后加入Radil抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后加二抗室溫孵育，最后加入氧化二氨基聯苯胺(DAB)常溫顯色，蒸餾水漂洗，逐級脫水，最后復染及封片，光鏡觀察。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 取對數生長期細胞，每T25培養瓶加入1 mL TRIzol試劑進行裂解，氯仿乙醇法進行抽提。所有RT-PCR反應所需要的試劑均購自TaKaRa公司。

1.5 蛋白質印跡法 取對數生長期細胞約1×106個，PBS洗后加入放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)裂解液，冰上裂解30 min。利用BCA法檢測蛋白質濃度，應用酶標儀檢測562 nm波長的光密度，根據標準曲線計算樣品的蛋白濃度。按照說明書配制分離膠和濃縮膠，上樣量為80 μg。Radil、actin、 E-cadherin、fibronectin，抗體購自英國Abcam公司。

1.6 細胞增殖實驗 取實驗組和對照組的對數生長期的細胞，調整成3×104個/mL密度，96孔板每孔接種100 μL，接種后每隔24 h加入10 μL 細胞計數盒8(CCK8)檢測液，用酶標儀進行吸光值檢測。

1.7 細胞遷移實驗 用DMEM將實驗組和對照組的細胞稀釋成1×106/mL單細胞懸液，取100 μL細胞懸液加入上室，下室加入300 μL懸液，并在DMEM培養液加10%胎牛血清；72 h后經4%多聚甲醛固定、Giemsa染液染色，顯微鏡下計數并拍照。

2 結 果

2.1 Radil在肝癌及癌旁組織中的表達情況 免疫組化染色發現，Radil主要表達在細胞質中，少量分布于細胞膜上(圖1A)。該蛋白在肝癌和癌旁組織中均有表達，其中肝癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織；WB結果也表明不同患者的Radil表達量不同，癌旁組織中的表達量顯著低于癌組織(圖1B)。這些數據表明，Radil可能對肝癌的發展具有促進作用。

圖1 Radil在肝癌組織中的表達

2.2 Radil 在肝癌細胞中的表達 通過RT-PCR和WB檢測分析肝癌細胞系中Radil的表達水平，結果發現具有轉移潛能的MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3細胞系中Radil的RNA和蛋白水平均顯著較高(圖2A、2B)。構建高表達Radil載體，轉染Huh7細胞，WB 驗證得到高表達Radil的Huh7細胞系(圖2C)；轉染shRNA至LM3細胞中，篩選得到低表達水平的LM3細胞系(圖2D)。

2.3 Radil對肝癌細胞增殖的影響 細胞增殖實驗結果發現，高表達Radil的Huh7細胞生長速度顯著高于對照組，而敲低Radil的表達則導致LM3細胞的生長速度顯著降低(圖3)。

2.4 Radil對肝癌細胞運動的影響 對照組和實驗組細胞的運動實驗表明，高表達Radil導致Huh7細胞的運動能力顯著增加(圖4A、4B)；降低Radil的表達顯著降低LM3細胞的運動能力(圖4C、4D)。

2.5 Radil促進肝癌發展可能的機制 進一步研究分析發現，Radil表達促進fibronectin的表達，E-cadherin的表達量降低，凋亡分子Bax的表達量減少。Radil低表達的細胞則高表達E-cadherin和 Bax(圖5)。這些數據表明，Radil可能通過促進細胞上皮細胞-間充質轉分化(EMT)，降低細胞凋亡來促進肝癌細胞的增殖和遷移，促進肝癌的發展。

圖2 Radil 在肝癌細胞中的表達

圖3 Radil對肝癌細胞增殖的影響

圖4 Radil對肝癌細胞運動的影響

圖5 WB檢測EMT和凋亡分子的表達水平

3 討 論

肝癌是全球發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，雖然診斷和治療技術的進步使肝癌患者的生存率有了較大的提高，但是術后的轉移與復發比例仍居高不下，探索肝癌轉移、復發的機制對于肝癌的治療具有重要的理論和臨床意義[1]。

腫瘤轉移是復雜的過程，需要多個步驟：腫瘤細胞間的黏附連接被破壞，腫瘤與胞外基質的黏附增加，金屬蛋白酶分泌增多，腫瘤細胞穿過基底膜進入血管，之后隨著血液流動進入其他組織形成新的轉移灶?？梢?，腫瘤細胞間連接和細胞與基質間的黏附連接對于腫瘤的轉移具有重要的意義。研究發現，Rap1通過結合下游效應分子Radil影響整合素激活、聚集，進而影響細胞延展、黏附和遷移過程，對腫瘤轉移有著重要的作用。敲低Radil可以有效降低乳腺癌細胞的遷移、侵襲能力，并阻斷乳腺癌的發展。過表達Radil可以促進乳腺癌細胞的增殖，并促進乳腺癌到肺臟的轉移[2]，本研究發現Radil在肝癌組織中高表達，其高表達可促進肝癌細胞增殖，增加肝癌細胞的運動能力，對肝癌發展具有促進作用。

Rap1是小分子G蛋白Ras家族中的一員，研究發現其活化后構象發生改變，與下游效應分子結合將信號轉導到細胞核中，參與激活多種信號通路，促進黏附連接的形成，影響細胞的增殖、極性、運動等多種生物學功能。Radil是新發現的Rap1分子下游效應分子之一，首次在神經鞘前體細胞中發現，低表達時可以顯著降低細胞的黏附能力，是神經鞘前體細胞黏附、運動的必需分子[3]。Radil可與Rap1、Gβγ亞基結合形成復合物，并使其從胞質轉移到細胞與基質黏附處, 促進細胞與基質的黏附連接。Radil過表達可以激活整合素，通過與胞外基質的黏附影響中性粒細胞的趨化作用。并激活局部黏著斑激酶(FAK)信號通路，促進間質細胞對纖連蛋白的黏附。敲低Radil可以減弱fMLP受體對細胞黏附的影響[4]。Rap1有多個效應分子，其他常見的效應分子有以下3種。(1)B-Raf，可以與Rap1結合，并被激活，但其具體的生物學功能與細胞類型、生長條件有關；(2)Ra-1，其可以與Rap1結合，但不被激活，與Rap1的結合導致了其不能與Ras結合，從而阻斷了Ras信號的轉導；(3)AF-6，其與Rap1結合后促進Rap1從核膜轉而定位到細胞膜，進而通過整合素調節細胞的黏附作用。研究發現，這些效應分子中只有Radil對細胞延伸有作用，但不同效應分子間功能是否有交叉和不同，仍需要更多的研究。

綜上所述，Radil通過影響細胞延伸、黏附連接影響腫瘤細胞的運動能力，進而影響腫瘤的轉移、復發，通過對Radil水平的檢測，將有助于了解腫瘤的惡性程度和轉移能力。