七氟醚對(duì)C57小鼠海馬基因表達(dá)的影響

韓曉丹， 孫敏莉

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海 200032

七氟醚是目前麻醉中應(yīng)用最廣泛的吸入性麻醉藥，具備血?dú)夥峙湎禂?shù)低、肝腎損害小和體內(nèi)代謝程度低等優(yōu)點(diǎn)，多年來(lái)一直用于小兒麻醉的誘導(dǎo)和維持[1]。2017年FDA發(fā)布了一項(xiàng)藥物安全性通告：即警告3歲以下嬰幼兒接受手術(shù)或醫(yī)療操作期間，重復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間使用七氟醚可能會(huì)影響小兒腦發(fā)育[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：新生小鼠(P7)多次暴露于七氟醚，其成年后空間學(xué)習(xí)記憶能力受損，明確七氟醚影響記憶的形成[3]。多項(xiàng)研究表明，早期暴露于七氟醚會(huì)導(dǎo)致發(fā)育期的海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡，同時(shí)出現(xiàn)持續(xù)的學(xué)習(xí)能力下降和記憶缺失[4-7]，但是目前細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明。

基因組微陣列技術(shù)的快速發(fā)展，使得我們能夠廣泛地分析細(xì)胞和組織中基因表達(dá)的變化。最近的研究表明，七氟醚可調(diào)節(jié)全腦和其他器官(如血液、心臟、肺)中多種基因的表達(dá)[8-10]。為了探討七氟醚神經(jīng)毒性的機(jī)制，需要研究與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程相關(guān)的海馬區(qū)基因表達(dá)的變化。本研究旨在通過(guò)微陣列分析來(lái)探討七氟醚對(duì)小鼠海馬基因組表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和七氟醚麻醉 12只出生第7天(P7)雄性C57BL/6小鼠(體質(zhì)量3～5 g，中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)隨機(jī)分為重復(fù)七氟醚麻醉組(RS組，n=6)和空氣對(duì)照組(C組，n=6)。將小鼠置于塑料容器中，連續(xù)5 d暴露于2.5%七氟醚(日本大阪Maruishi制藥公司)或空氣2 h/d，氣體流速為2 L/min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用加熱墊將容器加熱至37℃，使用氣體監(jiān)測(cè)儀(Datex CardiocapⅡ，Datex Ohmeda，Madison，WI，USA)監(jiān)測(cè)容器中七氟醚、氧氣和二氧化碳的濃度。實(shí)驗(yàn)后小鼠回到母鼠的籠子里，保持12 h的光/暗循環(huán)，且可以獲得足夠的食物和水。第5天暴露2 h后處死小鼠，提取海馬組織并立即冷凍在-80℃為RNA分離做準(zhǔn)備。

1.2 7 d齡小鼠海馬的提取 實(shí)驗(yàn)中使用帶倒刺的眼科鑷撕開(kāi)小鼠腦外皮，進(jìn)而撕開(kāi)頭骨，取出大腦。剝開(kāi)大腦，尋找外表面腦溝中間大概海馬傘位置，用手術(shù)剪取出海馬體，用PBS沖洗2遍后，洗去血液至澄清。剪出一部分海馬組織進(jìn)行RNA抽提，剩下組織放入凍存管中，于-80℃冰箱中凍存。

1.3 RNA分離與微陣列分析 實(shí)驗(yàn)中用Trizol法提取每個(gè)海馬組織的總RNA，用紫外分光光度法測(cè)定總RNA含量，用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量。對(duì)抽提的RNA進(jìn)行OD260/OD280檢測(cè)，結(jié)果表明小鼠海馬對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的RNA OD260/OD280比值均在1.85～2.0。我們進(jìn)而在QIAxcel儀器中進(jìn)行RNA質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)上述RNA的18S和28S均有峰值(圖1)，表明上述RNA質(zhì)量良好，符合下一步基因芯片實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中利用Affymetrix小鼠基因組230 2.0陣列(天津生物芯片公司，中國(guó)天津)進(jìn)行基因表達(dá)分析。基因微陣列在單個(gè)陣列上提供了轉(zhuǎn)錄小鼠基因組的全面覆蓋，包含31 000多個(gè)探針集，可以分析30 000多個(gè)轉(zhuǎn)錄基因和28 000多個(gè)經(jīng)證實(shí)的變異基因。應(yīng)用Affymetrix微陣列Syite軟件(MAS version 5.0)對(duì)每個(gè)探針組的信號(hào)進(jìn)行可靠性分析。收集6只RS組和6只C組小鼠的RNA，分別與微陣列雜交3次。根據(jù)Affymetrix協(xié)議，使用推薦的設(shè)備進(jìn)行標(biāo)記雜交和掃描。用鏈霉親和素-藻紅蛋白染色法檢測(cè)雜交RNA。使用3000 7G/4C掃描儀掃描微陣列，使用微陣列套件軟件(5.0版)處理數(shù)字化圖像數(shù)據(jù)。利用Affymetrix基因芯片3000-TG系統(tǒng)對(duì)微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)，最終獲得基因表達(dá)譜。根據(jù)這些變化計(jì)算RS組和C組小鼠海馬差異表達(dá)基因的比率概率，P<0.05的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)的基因，同時(shí)進(jìn)行差異基因的功能分類和信號(hào)通路分析。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 對(duì)用于微陣列分析的RS組和C組小鼠的總RNA進(jìn)行以下處理。在反轉(zhuǎn)錄之前，利用DNase(TaKaRa，Shiga，Japan)清除可能被污染的殘余基因組DNA。1 μg RNA提取物在37℃下于20 μL反應(yīng)混合物中逆轉(zhuǎn)錄15 min，該反應(yīng)混合物包含小鼠Meloney白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶、2.5 μmol/L六核苷酸隨機(jī)引物和2.5 μmol/L寡糖(dT)18，使用了primescript RT試劑盒(TaKaRa，Shiga，日本)。

相對(duì)定量PCR(real-time PCR)可以在不同條件下對(duì)大多數(shù)差異基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定和研究，PCR反應(yīng)每20 μL包含2 μL cDNA模板、0.4 μmol/L前向引物、0.4 μmol/L反向引物，使用Platinum SYBR Green qPCR superMixUDG試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。PCR條件為：50℃擴(kuò)增2 min，95℃擴(kuò)增10 min，95℃擴(kuò)增15 s，60℃擴(kuò)增30 s，70℃擴(kuò)增20 s，所有的基因特異性引物見(jiàn)表2。

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)cDNA擴(kuò)增為內(nèi)對(duì)照，未知樣品和內(nèi)控樣品一式三份，該分析使用了能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量熒光的儀器(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。PCR的結(jié)果表示為閾值周期(Ct)值，其中Ct是一個(gè)無(wú)單位值，定義為樣本熒光信號(hào)在基線以上通過(guò)固定閾值的分?jǐn)?shù)周期數(shù)。所有mRNAs的相對(duì)微分比通過(guò)比較Ct法(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)計(jì)算，使用方程2-ΔΔCt(其中ΔCt為未知樣本與GAPDH對(duì)照組的Ct值之差，而ΔΔCt為配對(duì)樣本之差，即ΔΔCt=C組樣本ΔCt值-RS組樣本的ΔCt值)。由于操作不準(zhǔn)確，三份結(jié)果中明顯不同的值會(huì)被省略。在實(shí)際操作中，如果Ct值與其他兩個(gè)值不同，并且兩者的平均值相差1.00或以上，則省略該值。

圖1 對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬組織RNA質(zhì)檢結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因(DEG)檢測(cè)的微陣列分析 差異表達(dá)基因的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是兩個(gè)微陣列分析的表達(dá)水平的平均變化倍數(shù)(log2比值)大于1.5或小于-1.5(RS組/C組)。本研究結(jié)果顯示，與C組相比較，RS組有上調(diào)的16個(gè)基因和下調(diào)的14個(gè)基因發(fā)生了顯著變化(P<0.05，表1)。為了全面了解基因表達(dá)的差異狀況，使用火山圖來(lái)呈現(xiàn)配對(duì)樣本間差異表達(dá)的基因(圖2)，然后用相同方法得到差異表達(dá)基因的熱圖(圖3)，同時(shí)對(duì)差異表達(dá)的基因(包括上調(diào)的16個(gè)基因和下調(diào)的14個(gè)基因)進(jìn)行了功能分析和信號(hào)通路分析(圖4)。這些基因是七氟醚調(diào)控的靶點(diǎn)，與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通訊、結(jié)構(gòu)和囊泡過(guò)程、生命物質(zhì)結(jié)合和定位有關(guān)，可能參與cAMP信號(hào)通路、晝夜節(jié)律、多巴胺能突觸、催產(chǎn)素通路等多個(gè)信號(hào)通路。

表1 重復(fù)七氟醚暴露后小鼠海馬上調(diào)和下調(diào)的已知基因

圖2 差異表達(dá)基因的火山圖

圖3 差異表達(dá)基因的熱圖

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗(yàn)證差異表達(dá)基因 在mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，以GAPDH為內(nèi)參，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR分析以驗(yàn)證微陣列結(jié)果(表2)。隨機(jī)選擇9個(gè)差異表達(dá)基因，與C組相比較，RS組有3個(gè)上調(diào)基因(Ppp1r1b、Id1和Txnip)和5個(gè)下調(diào)基因(Arc、c-Fos、Npas4、Grin2a和Kcnj2，P<0.05)?；騎et2在RS組和C組之間沒(méi)有差異表達(dá)。RT-PCR的相對(duì)定量結(jié)果(圖5)與微陣列結(jié)果一致。

圖4 七氟醚處理后海馬差異表達(dá)基因功能分析和信號(hào)通路分析

表2 RT-PCR 基因特異性引物

3 討 論

近年來(lái)，七氟醚的神經(jīng)毒副作用，尤其是對(duì)認(rèn)知功能障礙的影響受到人們廣泛地關(guān)注，臨床研究顯示，患兒接受七氟醚全身麻醉后可發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間的行為學(xué)改變和認(rèn)知能力的下降；動(dòng)物研究表明，發(fā)育期大鼠暴露于七氟醚會(huì)導(dǎo)致廣泛的海馬神經(jīng)元凋亡和空間學(xué)習(xí)能力嚴(yán)重缺陷[11-13]。另有研究證明，七氟醚對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的潛在毒性機(jī)制可能是通過(guò)DNA甲基化[14]。此外，Hu等[15]還報(bào)道了抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)的mRNA表達(dá)可以減少由七氟醚誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。然而目前七氟醚神經(jīng)毒性的具體分子機(jī)制尚未明確，特別是在差異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面少有研究。

圖5 RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

微陣列分析被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和疾病中基因表達(dá)變化的有效工具。本研究分析了7 d齡小鼠的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)重復(fù)七氟醚麻醉后，海馬中有16個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，14個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。值得注意的是，這些差異表達(dá)基因與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通訊、結(jié)構(gòu)和囊泡過(guò)程、生命物質(zhì)結(jié)合和定位有關(guān)。這些差異表達(dá)的基因可能參與了七氟醚引起的認(rèn)知功能障礙過(guò)程。一項(xiàng)微陣列研究[9]發(fā)現(xiàn)，幼年大鼠重復(fù)暴露于4.5%七氟醚后取全腦組織，有42個(gè)基因顯著改變，其中調(diào)節(jié)腦內(nèi)苯丙胺及晝夜節(jié)律的相關(guān)基因與本研究相符。Liu等[16]報(bào)道將幼年猴暴露于2.5%七氟醚中9 h，采集額葉皮質(zhì)組織進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、功能和神經(jīng)細(xì)胞的活性有關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠暴露于2.5%七氟醚4 h，采集海馬組織進(jìn)行全基因組的微陣列分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)的基因與記憶功能障礙相關(guān)，其中催產(chǎn)素信號(hào)通路與本研究一致[10]。然而，這些研究中差異表達(dá)的基因與本研究中改變的基因并不相同，這可能與動(dòng)物的類型、麻醉藥物的劑量和作用時(shí)間、所取腦內(nèi)的部位等不同相關(guān)。

在30個(gè)差異表達(dá)基因中，Arc和Fos與小鼠學(xué)習(xí)記憶能力呈高度相關(guān)。Arc編碼活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，在記憶、抑郁、神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性和藥物成癮等方面發(fā)揮重要作用。Guzowski等[17]首次報(bào)道了海馬內(nèi)注入Arc反義基因，發(fā)現(xiàn)Arc基因敲除后會(huì)損害長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的鞏固和長(zhǎng)期空間記憶能力。類似的證據(jù)顯示，在小鼠背側(cè)海馬中注入Arc反義基因抑制Arc的合成，會(huì)導(dǎo)致抑制性回避記憶的發(fā)生[18]。此外，在恐懼條件反射中，Arc的表達(dá)增加且依賴于ERK基因，Arc是外側(cè)杏仁核長(zhǎng)期記憶構(gòu)建的重要條件之一[19]。綜上所述，這些研究均說(shuō)明了Arc在嚙齒類動(dòng)物長(zhǎng)期記憶形成中的重要性。在我們的研究中，通過(guò)微陣列檢測(cè)和RT-PCR驗(yàn)證的Arc基因下調(diào)可能是七氟醚致幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的關(guān)鍵因素。在小鼠重復(fù)吸入七氟醚的模型中，我們還發(fā)現(xiàn)了Fos基因表達(dá)下調(diào)。Fos又稱c-Fos，編碼亮氨酸拉鏈蛋白，可使JUN家族蛋白發(fā)生二聚，從而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，在DNA水平下控制基因表達(dá)。Fos屬于即刻早期基因(IEGs)，其表達(dá)的增加通常代表神經(jīng)元的激活。Guzowski在大鼠模型中使用反義寡核苷酸(ASO)，發(fā)現(xiàn)c-Fos-ASO的輸注會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期空間記憶的缺陷[20]。阻斷海馬中c-Fos的表達(dá)也可能導(dǎo)致長(zhǎng)期記憶儲(chǔ)存出現(xiàn)持續(xù)性的缺陷[21]。另有研究表明，c-Fos可以與組蛋白脫乙?；?3(HDAC3)相互作用，以防止HDAC3神經(jīng)毒性[22]。這些研究不僅突出了c-Fos在記憶儲(chǔ)存和神經(jīng)元保護(hù)中的關(guān)鍵作用，而且為重復(fù)七氟醚麻醉小鼠模型提供了可能的分子機(jī)制。本研究中其他的下調(diào)基因也與神經(jīng)發(fā)育與認(rèn)知功能障礙相關(guān)，如神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4(Npas4)可調(diào)控神經(jīng)元之間的突觸連接[23-25]，其基因敲除小鼠呈現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙和癲癇癥狀[26]；Grin2a可編碼N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDAR)亞單位GluN2A，它的改變與一系列具有顯著言語(yǔ)相關(guān)特征的神經(jīng)發(fā)育障礙和癲癇有關(guān)[27]。七氟醚在多個(gè)層面上影響認(rèn)知功能，包括受體、離子通道、第二信使系統(tǒng)、酶以及細(xì)胞骨架成分，本研究中差異表達(dá)的基因Txnip、Ppp1r1b、Id1和Kcnj2可能分別從細(xì)胞代謝、第二信使系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和離子通道這些方面來(lái)影響認(rèn)知功能[28-31]。研究表明認(rèn)知功能是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，一個(gè)基因可以影響多個(gè)過(guò)程，而多個(gè)基因可以影響一個(gè)過(guò)程，多個(gè)認(rèn)知過(guò)程是相互關(guān)聯(lián)的[32]。因此，推測(cè)七氟醚引起的認(rèn)知功能障礙可能是多種基因改變的結(jié)果，這些結(jié)果提示還需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究利用微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)了七氟醚麻醉后幼鼠海馬基因轉(zhuǎn)錄的改變。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)了一部分基因在七氟醚的作用下明顯失調(diào)。Arc、c-Fos和Npas4等基因的差異表達(dá)可能在幼鼠七氟醚神經(jīng)毒性中起著關(guān)鍵的作用，為闡釋七氟醚引起神經(jīng)毒性的作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)。