生物信息學分析長鏈非編碼RNA在結腸癌中的調控網絡

韓澤平 李艷 黎毓光 呂鈺冰 何思華 何金花

結腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率居常見惡性腫瘤的第3位，病死率也為癌癥死亡的第3位[1]，嚴重威脅人類的生命和健康。由于早期結腸癌患者臨床癥狀較隱匿，多數結腸癌患者被發現時已至中晚期。目前，手術切除仍是治療結腸癌的首選方法，但術后高復發率、高轉移率和5年低生存率等難題一直未有效解決，結腸癌患者的預后仍然很差[2]，因此尋找新的診斷和治療方法尤為重要。近年發現，一些長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可作為結腸癌診斷、預后的生物標志物，廣泛影響結腸癌細胞增殖、侵襲、凋亡、轉移和耐藥能力[3]。lncRNA是一類轉錄本長度＞200 nt的非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），其中絕大多數不具有或僅具有有限的蛋白質編碼能力，但是它們能對mRNA轉錄后加工，包括5憶加帽、剪接和聚腺苷酸化，參與機體生理及病理過程[4]。

生物信息學是在生命科學的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學。利用生物信息學方法可預測lncRNA在結腸癌發生、發展中的調控網絡，可大大節省實驗室驗證的工作量。本研究運用生物信息學方法，從lncRNA出發探索其與上游轉錄因子、下游靶微小 RNA（microRNA，miRNA）及 miRNA 靶基因間的調控關系，以更好理解lncRNA在結腸癌發生、發展過程中的作用機制，并為下一步實驗驗證其分子調控網絡機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究所用到的生物學信息軟件和數據庫如下：lncRNA 疾病數據庫（http://www.cuilab.cn/lncr原nadisease），治療lncRNA疾病關聯數據的實驗資源，是一種用于預測新型lncRNA相關疾病的綜合工具[5]。Starbase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/），系統地識別和確立 RNA-RNA、protein-RNA、miRNA-mRNA 和 miR原NA-lncRNA的交互網絡[6]。人類miRNA疾病數據庫（HMDD v3.0，http://www.cuilab.cn/hmdd），集人 miRNA的實驗驗證支持和疾病關聯的數據庫[7]。PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）；Consite（http://consite.genereg.net/），通過基因結合位點進行預測的在線數據工具，用于查找基因組序列中的順式調控元件[8]。Long Noncoding RNA Database v2.0（http://www.lncrnadb.org/）；miRBase（http://www.mirbase.org/）；miRwalk2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/），一個關于miRNAs的在線軟件，該數據庫包含了關于人類、小鼠和大鼠等所有已知基因的信息，可用于預測和驗證miRNA的結合位點[9]。Cytoscape軟件。

1.2 方法

1.2.1 預測與結腸癌相關的lncRNAs 在lncRNA疾病數據庫中通過“Browse”進入瀏覽界面，在疾病選項欄中選取“colon cancer”作為研究對象，篩選出和結腸癌相關的lncRNAs，并挑選出前3個研究較多的lncRNAs作為下一步的研究對象。

1.2.2 預測與lncRNAs相關的miRNAs 運用Starba原sev2.0在線軟件可預測出與lncRNAs相關的miRNAs。通過“miRNA Target”進入“miRNA-lncRNA”調控網絡預測界面，提交目的lncRNA后可獲得預測相互結合的miRNAs。

1.2.3 查詢已證實與結腸癌相關的miRNAs 通過HMDD v3.0查詢已證實的與結腸癌相關的miRNAs。

1.2.4 篩選與lncRNAs和結腸癌相關的miRNAs 將上述所得出與lncRNAs相關的miRNAs和已證實與結腸癌相關的miRNAs作交集并篩選出共同的miRNAs。

1.2.5 預測與lncRNAs相關的轉錄因子 在Consite數據庫中預測出各lncRNA的轉錄因子并作交集篩選出它們共同的轉錄因子，通過Pubmed查詢轉錄因子在結腸癌中的調控機制。

1.2.6 預測各miRNA的轉錄因子 運用Consite數據庫預測出各miRNA的轉錄因子并進行分析研究，篩選出上述miRNAs的共同轉錄因子，并通過Pubmed數據庫查詢轉錄因子與結腸癌的關系。

1.2.7 預測各miRNA的靶mRNA 通過miRwalk v2.0查詢上述miRNAs的靶mRNA，并且進行交集后篩選出共同靶基因。并利用Pubmed數據庫篩選出與結腸癌相關的共同靶基因。

1.2.8 繪制網絡調控圖 綜合以上結果，運用Cytoscape軟件繪制出lncRNA在結腸癌中的調控網絡圖。

2 結果

2.1 與結腸癌相關的lncRNAs 通過lncRNA疾病數據庫查詢得出與結腸癌相關的lncRNAs為H19、HO原TAIR、MALAT1、MEG3、GSEC、CYTOR、TUG1、RBM5-AS1、LINC-ROR、UCA1、UPAT、UHRF1、ATB、FER1L4、CCAT1、SNAR、CCAT2等 17個（表 1）。如表 1所示，該數據庫收錄的H19、HOTAIR、MALAT1與結腸癌的研究相對較多，因此本研究選取H19、HOTAIR和MALAT1作為進一步的研究對象。

2.2 與lncRNAs相關的miRNAs 在Starbase v2.0中預測得出與H19相關的miRNAs共39個，與HOTAIR相關的miRNAs共30個，與MALAT1相關的miRNAs共113個。其中 H19、HOTAIR、MALAT1 3個共同的靶miRNAs 為 miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-519d等7個miRNAs（圖 1）。

2.3 已證實的與結腸癌相關的miRNAs 經HMDDv2.0輸入“colon cancer”查詢得已證實過的與結腸癌相關的miRNAs共90個（圖 2）。

2.4 與lncRNAs和結腸癌相關的miRNAs 將 H19、HOTAIR、MALAT1共同的7個靶miRNAs與上述所得的已證實與結腸癌相關的90個miRNAs作交集后篩選得共同靶miRNAs miR-17、miR-20a、miR-106a 和miR-106b等與結腸癌密切相關，并將它們納入后續研究對象（圖3）。

2.5 與lncRNAs相關的轉錄因子 在Consite中分別預測3個lncRNAs的轉錄因子，進而篩選出它們的共同轉錄因子；在設定cut-off為90%的條件下預測得H19共有12個轉錄因子，HOTAIR的轉錄因子共18個，MALAT1的轉錄因子共31個；其中 E74A、ARNT、Thing1-E47、Hunchback、Snail為lncRNAs的共同轉錄因子（圖 4）。

2.6 與miRNAs相關的轉錄因子 在Consite分別預測各miRNA的轉錄因子，并且篩選出它們的共同轉錄因子；在設定cut-off為70%的條件下預測得到miR-17的轉錄因子共14個，miR-20a的轉錄因子共18個，miR-106a的轉錄因子共15個，miR-106b的轉錄因子共7個；取交集后 Sox-5、FREAC-4、Sox-17、ARNT、Snail為miRNAs的共同轉錄因子（圖5）。

表1 與結腸癌相關的lncRNAs

圖1 與lncRNAs相關的miRNAs

圖2 已證實的與結腸癌相關的部分miRNAs

圖3 與lncRNAs和結腸癌相關的miRNAs

圖4 各lncRNA的轉錄因子及其共同轉錄因子

圖5 各miRNA的轉錄因子及其共同轉錄因子

2.7 與結腸癌相關的轉錄因子 通過Pubmed查閱文獻找到已有文獻證實與結腸癌相關的轉錄因子，其中已證實與結腸癌相關的lncRNAs轉錄因子為ARNT和Snail，miRNAs轉錄因子中 ARNT、Snail、Sox-17 參與結腸癌的發生和發展。其中，ARNT和Snail為lncRNAs與miRNAs的共同相關轉錄因子（圖6）。

圖6 與結腸癌相關的轉錄因子

2.8 與結腸癌相關miRNA的靶mRNA 運用miRwalk v2.0經Predicted Target Module寅MicroRNA-geneTargets查詢頁面進入，分別輸入 miR-17、miR-20a、miR-106a、miR-106b預測得各miRNA的靶mRNA。其中同時滿足11個或以上預測模塊的條件下預測得miR-17共42個靶基因，miR-20a共50個靶基因，miR-106a共42個靶基因，miR-106b共36個靶基因。進一步運用一致法篩選得到 4個 miRNAs的共同靶基因為 HLF、SORL1、ZFYVE26、PFN2、PKD2、PKN2、PTPN4、RBL2、WEE1、FZD3、RGL1、MKRN1、C7orf43、NTN4、ZFP91等15個靶基因（見表2）。經Pubmed數據庫查詢，篩選得PKD2、PKN2、WEE1、ZFP91等4個靶基因與結腸癌相關。

表2 與結腸癌相關的miRNA的靶基因

2.9 繪制miRNA在結腸癌中的分子調控網絡圖 根據上述結果，在lncRNA這一環，通過數據庫預測并篩選得到H19、HOTAIR、MALAT1等3個與結腸癌相關的lncRNAs，進一步分別預測出它們的下游miRNAs并且用一致法篩選得到共同的miRNAs有miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-519d 等 7個。同樣運用數據庫查詢得到90個與結腸癌相關的miRNAs。與上述 H19、HOTAIR、MALAT1 等 lncRNAs相關的 miRNAs 取交集得 miR-17、miR-20a、miR-106a、miR-106b等4個與結腸癌密切相關的miRNAs。同時，在轉錄因子水平預測出3個lncRNAs共同的轉錄因子為 E74A、ARNT、Thing1-E47、Hunchback、Snail 5 個。此外，預測出4個miRNAs的共同轉錄因子為Sox-5、FREAC-4、Sox-17、ARNT、Snail 5 個，在 Pubmed 中查閱有文獻證明與結腸癌相關的轉錄因子有ARNT、Sox-17、Snail，并且ARNT和Snail同時與lncRNAs 和miRNAs相關。最后預測得 miR-17、miR-20a、miR-106a、miR-106b分別可共同調控HLF、SORL1、ZFYVE26、PFN2、PKD2、PKN2、PTPN4、RBL2、WEE1、FZD3、RGL1、MKRN1、C7orf43、NTN4、ZFP91等15個靶基因，其中PKD2、PKN2、WEE1、ZFP91 可找到相關文獻證實與結腸癌有關。綜合以上，構建出miRNA在結腸癌中的分子調控網絡圖（圖苑）。

圖7 miRNA在結腸癌中的分子調控網絡圖

3 討論

生物信息學是一門新興的學科，通過綜合數學、統計學、計算機科學與工程、生物學的工具與技術研究生物信息的采集、處理、存儲、分析和解釋各種信息的生物學意義，并予以管理和利用的一門科學，其目標是發展和利用先進的計算技術解決生物學難題[10]。生物信息學依靠計算機工具和互聯網技術開發出各種用于基因研究的數據庫，通過分析、處理實驗數據和公共數據可預測及篩選出研究者想要的信息，加快了研究進度，縮短了科研時間；利用實驗數據分析所得的結論可設計下一階段的實驗，并可用計算機管理實驗數據并預測新基因及其結構和功能，從而一步步破解復雜的生物信息，為各種疾病的診斷、治療提供更明確的方向。

本研究運用生物信息學分析lncRNA在結腸癌發生、發展中的分子調控網絡。利用lncRNA疾病數據庫查詢得與結腸癌相關的lncRNAs有17個（見表1），并且選取H19、HOTAIR、MALAT1等前3個與結腸癌相關性最高的lncRNAs為研究對象。研究報道，lncRNA H19在結腸癌組織中表達上調，并通過MAPK信號通路促進結腸癌細胞的遷移和侵襲[11]；Luo等[12]從80個結腸癌組織和腫瘤鄰近正常結腸組織中檢測HOTAIR的表達發現HOTAIR在結腸癌組織中的表達顯著高于匹配的腫瘤相鄰正常結腸組織，在淋巴結轉移病例中的表達明顯高于無轉移病例，在低分化和未分化病例中高于中度分化病例，HOTAIR在結腸癌可能扮演癌基因角色。MALAT1是結腸癌中的一個致癌基因，可通過上調H3K27三甲基化和抑制GSK-3蛋白表達進而抑制茁-catenin降解，促進結腸癌的生長[13]。

lncRNA可通過競爭性結合miRNA，抑制miRNA表達及其對下游靶基因的負向調控作用[14]。本研究進一步在 Starbase v2.0中預測得 H19、HOTAIR、MALAT1 3個共同的 miRNA 為 miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-519d等 7個。HMDD v2.0數據庫查詢得出與結腸癌相關的miRNAs共90個，進一步將H19、HOTAIR、MALAT1共同的7個靶miRNAs與上述已證實與結腸癌相關的90個miRNAs作交集后篩選出共同的 miRNAs，分別為 miR-17、miR-20a、miR-106a和miR-106b。通過Pubmed文獻分析，miR-17在結腸癌早期表達顯著上調[15-16]并且在結腸癌晚期通過抑制其下游基因PTEN的表達而促進了結腸癌細胞的增殖和侵襲[17]。miR-20a在結腸癌中表達上調，它通過負調控結腸間質成纖維細胞中其靶CXCL8 mRNA的表達抑制腫瘤細胞生長[16，18]。miR-106a結腸癌中處于高表達狀態[16，19]，并且有研究證明其與PTEN存在靶向調控關系，在結腸癌組織中起著致癌作用[19]。miR-106b表達增強，負向調控其靶DLC1并誘導結腸癌細胞的遷移和侵襲，為結腸癌患者的獨立預后因素[20]。

眾所周知，轉錄因子是參與目的基因表達的重要調控因子。筆者圍繞轉錄因子與lncRNAs和miRNAs的靶向調控關系在Consite中分別預測各lncRNAs與miRNAs的轉錄因子并得到lncRNAs共同的轉錄因子為 E74A、ARNT、Thing1-E47、Hunchback、Snail等 5 個，miRNAs共同的轉錄因子為 Sox-5、FREAC-4、Sox-17、ARNT、Snail等5個。取交集后，在Pubmed中查閱文獻發現已證實與結腸癌相關的轉錄因子為Sox-17、ARNT、Snail。Sox-17在結腸癌中通過Wnt信號通路發揮腫瘤抑制作用，在腫瘤早期階段被Wnt激活誘導，在惡性進展過程中被甲基化下調[21]。ARNT在腫瘤早期通過誘導參與腫瘤生長和血管生成的基因廣泛參與腫瘤的生長，但在腫瘤的侵襲和轉移過程中起著負向作用，這說明ARNT在腫瘤不同時期的靶向治療中有不同的提示作用[22]，但尚未找到研究ARNT與結腸癌調控關系的資料。有關文獻表明，Snail在結腸癌中表達上調，參與結腸癌的病程進展，與其晚期淋巴結轉移、預后不良有關[23-24]。

通過miRwalk v2.0在線軟件預測得出與結腸癌密切相關的miRNAs的共同靶mRNAs有 HLF、SORL1、ZFYVE26、PFN2、PKD2、PKN2、PTPN4、RBL2、WEE1、FZD3、RGL1、MKRN1、C7orf43、NTN4、ZFP91 等 15 個。有研究表明，PKD2是PKD在結腸癌中表達最豐富的亞型，其通過表達上調在腫瘤細胞的生長和增殖中起著積極作用[25]。PKN2在結腸癌中表達降低，其在正常結腸組織中表達高于息肉、腺瘤和轉移性腺癌，并且在腫瘤中較高的表達傾向提示預后良好，PKN2在結腸癌中起著腫瘤抑制作用[26]。WEE1是一種癌基因，它在結腸癌中的表達上調與惡性程度高、預后差有關，通過抑制WEE1可以有明顯的抗腫瘤作用，并且提示WEE1可能是P53突變型結腸癌有效的治療靶點[27-28]。ZFP91在結腸癌中表達顯著上調，并且通過正向調控HIF-1琢促進腫瘤細胞的血管生成、增殖和轉移[29]。然而未找到HLF、SORL1、ZFYVE26、PFN2、PTPN4、RBL2、FZD3、RGL1、MKRN1、C7orf43、NTN4等與結腸癌的相關文獻報道。

綜上所述，本研究構建出了結腸癌相關的lncRNAs分子調控網絡。通過這個相對系統的網絡，我們可知在結腸癌中 H19、HOTAIR、MALAT1、miR-17、miR-20a、miR-106a、miR-106b、Snail、PKD2、WEE1、ZFP91 等 表達上調，促進了結腸癌細胞的生長和增殖，Sox-17、PKN2表達下調并且起著抑制作用，而ARNT在腫瘤生長期表達上調并起促進作用，在腫瘤轉移和侵襲期表達下調并有著抑制功能。基于此調控網絡，進一步的研究方向中能更有針對性地尋找治療方法來降低H19、HOTAIR、MALAT1、miR-17、miR-20a、miR-106a、miR-106b、Snail、PKD2、WEE1、ZFP91 和腫瘤細胞生長期的ARNT的表達水平，以及提高Sox-17、PKN2、轉移和侵襲期的ARNT的表達以達到有效治療結腸癌的目的。

生物信息學分析技術始終運用于整個分子調控網絡的構建過程中，雖然所得到的調控網絡僅僅是從理論層面上推導而來，其可行性尚還需要進一步的實驗加以證明，但為下一步的實驗驗證指明了方向。生物信息學分析與實驗驗證的結合為我們更準確高效地研究結腸癌提供了更多的依據和可能。