基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的價值

趙金云 許文芳 金法祥

革蘭陰性桿菌，尤其是腸桿菌科是導致院內及社區獲得性感染的主要原因，可引起人體多種系統感染。此類細菌可產生多種耐藥酶，包括超廣譜茁-內酰胺酶，質粒AmpC型茁-內酰胺酶和碳青霉烯酶等[1]，因此可對多種抗生素耐藥。碳青霉烯類抗生素被認為是抗感染治療的最后一道防線，但在過去的十年里，耐碳青霉烯腸桿菌科細菌的出現和傳播，尤其是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）具有較高的發病率和病死率，對公眾健康造成了嚴重威脅[2-3]。快速而準確地鑒定出CRKP可盡早為臨床控制和預防感染提供幫助。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-fligh mass spectrometer,MALDI-TOF MS）技術作為一種新型快速的微生物鑒定方法，由于其諸多優勢越來越受到實驗室的青睞[4]。本研究評估MALDI-TOF MS技術在臨床實驗室中快速鑒定CRKP的價值，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 選擇2019年10月至2020年3月本院住院感染患者分離的肺炎克雷伯菌140株（去除重復菌株）。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603。全部菌株經常規生化及法國梅里埃Vitek 2-Compact全自動細菌鑒定儀鑒定，用亞胺培南紙片篩選出CRKP 33株，檢出率為 23.57%。其中 26株（78.79%）來自男性，7株（21.21%）來自女性。標本類型以痰液11例（33.33%）和尿液8例（24.24%）為主，其次為膿液5例（15.15%）、血液5例（15.15%）、導管2例（6.06%）和分泌物2例（6.06%）；內科分離菌株數多于外科，其中分離自重癥醫學科最多，為10例（30.30%），其次為老年醫學科8例（24.24%），之后是呼吸科5例（15.15%）、消化內科4例（12.12%）、內分泌科2例（6.06%）、普外科2例（6.06%）和骨科2例（6.06%）。

1.2 試劑和儀器 細菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒以及電泳儀由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

1.3 藥敏試驗 根據美國臨床和實驗室標準協會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）指南，通過微量肉湯稀釋法對收集的CRKP進行藥物敏感性測定，結果參照CLSI M100-S27標準。

1.4 耐藥基因檢測

1.4.1 細菌DNA提取 挑取單個菌落置入已預混好的60滋l Triton X-100（終濃度為0.45%）與蛋白酶 K（終濃度為200 ng/ml）溶液中，然后56益溫浴90 min，再94益溫浴25 min。冷凍保存待檢。

1.4.2 耐藥基因檢測 采用PCR方法檢測33株CRKP中的碳青霉烯酶編碼基因，包括blaGES、blaKPC、blaIPM、blaVIM、blaNDM和blaOXA-48，引物序列如表1所示。每種基因檢測PCR擴增的反應總體積為20滋l：包括重組耐熱DNA聚合酶（日本Takara公司產品）1個單位（體積0.2滋l），10倍濃度的緩沖液2滋l；P1引物2滋l（1.0滋mol/L），P2引物2滋l（1.0滋mol/L）；dNTP混合液2滋l（各種濃度均2 mmol/L）；超純水7滋l以及菌株DNA提取液4.8滋l。PCR檢測擴增熱循環為：95益預變性3 min，然后95益變性0.5 min，55益復性0.5 min，72益延伸1.0 min，共30循環，最后72益延長至5 min。經2%瓊脂糖凝膠潛水式電泳20 min，出現與陽性對照分子量相同的條帶即判別為陽性。對陽性產物進行測序并將獲得的DNA序列與NCBI GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的DNA序列進行比較。

表1 基因引物序列及擴增片段長度

1.5 CRKP鑒定 采用MALDI-TOF MS鑒定CRKP，挑取單個菌落均勻涂抹在靶板樣本孔位上，記錄位置和編號，滴加1滋l 70%甲酸，晾干后滴加1滋l基質溶液，再次晾干后使用MALDI Biotyper RTC模式進行檢測，利用flexAnalysis軟件分析蛋白圖譜。

2 結果

2.1 CRKP對抗菌藥物的敏感性 見表2。

由表2可見，所有菌株對碳青霉烯類和頭孢菌素類抗生素的耐藥率均為100.00%；僅1株對氨曲南敏感；對氟喹諾酮類抗生素（環丙沙星和左氧氟沙星）的耐藥率略低，但均在80.00%左右；對氨基糖苷類抗生素（慶大霉素和阿米卡星）的耐藥率最低，但均高于60.00%。共有20株（60.61%）CRKP對上述3種以上抗菌藥物耐藥，因此定義為多重耐藥菌株。

2.2 耐藥基因檢測結果 見圖1-2（圖1見插頁）。

圖1 blaKPC測序結果

由圖1可見，blaKPC基因序列圖譜與NCBI Gen原Bank數據庫中序列一致。進一步檢測發現共有24株CRKP攜帶blaKPC基因，其余9株未檢測出碳青霉烯酶編碼基因；未檢測出blaGES、blaIPM、blaVIM、blaNDM和blaOXA-48基因。

表2 臨床分離CRKP對抗菌藥物的敏感性

由圖2可見，33株CRKP基于碳青霉烯酶編碼基因的親緣關系主要分為兩大類。由MLST分型得出，有27株（81.82%）為 ST11型，其余 6株（18.18%）為 ST15，且24株攜帶blaKPC的CRKP均為ST11型。

2.3 CRKP蛋白圖譜 見圖3。

圖2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯細菌（CRKP）基于碳青霉烯耐藥基因的親緣關系分析

圖3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯細菌（CRKP）蛋白圖譜

如圖3所示，其中a為產KPC的CRKP，b為不產KPC的CRKP，c為質控菌株。三者蛋白圖譜總體一致，且在11109-Da處均無特征峰。

3 討論

碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌乃至腸桿菌科細菌對碳青霉烯抗生素產生耐藥的主要機制，碳青霉烯酶主要分為以下3類，A類：絲氨酸碳青霉烯酶（KPC，GES）；B類：金屬-茁-內酰胺酶（MBL）（IMP，VIM，NDM）和 D 類：OXA 酶和類 OXA 酶（OXA-23，OXA-48）[5]。目前，檢測碳青霉烯酶的方法主要包括表型測定法和分子檢測法，前者主要包括改良的Hodge試驗，Carba NP試驗和碳青霉烯酶滅活法；而后者主要包括多重聚合酶鏈反應，微陣列和全基因組測序[6]。如今，越來越多的實驗室引入了MALDI-TOF MS技術用于檢測耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌，尤其是CRKP。

本研究通過VITEK-2 Compact以及亞胺培南紙片共篩選出33株CRKP，大部分分離自痰液和尿液，且多數來源于內科。所有菌株對碳青霉烯類以及頭孢菌素類產生耐藥，只有對氨基糖苷類抗生素耐藥率稍低，通過微量肉湯稀釋法檢測出20株CRKP（60.61%，20/33）為多重耐藥菌株，此比例與長江流域其他地區一致，但高于東北地區[7-8]。33株CRKP中僅檢測出blaKPC（72.73%，24/33），說明產碳青霉烯酶并非為本研究中CRKP耐碳青霉烯類抗生素的唯一耐藥機制，剩余的9株CRKP可能為外膜孔蛋白減少或缺失伴高水平茁-內酰胺酶的持續產生，亦或是主動外排系統亢進，但仍需進一步進行檢測。從國外的研究分析中得出，產KPC肺炎克雷伯菌在11109-Da處有特異峰[9-10]，因此筆者將CRKP分為產KPC和不產KPC兩組，均用MALDI-TOF MS進行蛋白圖譜分析，但并未發現兩組CRKP的蛋白圖譜有較大區別，且產KPC組在11109-Da處并未出現特殊峰，這與之前的報道并不一致。從菌株的MLST分型結果得出本地區CRKP主要表現出ST11和ST15兩種型別，這與其他報道稱國內CRKP流行株主要為ST11型相符合[11]，而國外報道中則表明國外CRKP流行株主要為ST258型[12]，這可能是沒有在11109-Da處發現特殊峰的主要原因。當然本研究可能受到菌株數的影響，就碳青霉烯耐藥基因而言，菌株親緣關系較近，同時并未檢測到其他碳青霉烯耐藥基因以及其他型別，因此，本結論只適用于本院的ST11和ST15型CRKP。

綜上所述，本院CRKP對抗菌藥物具有較高的耐藥率，對碳青霉烯的耐藥機制以產KPC酶為主。就本院而言，MALDI-TOF MS無法區分ST11型產KPC和非產KPC的CRKP，也無法區分CRKP的ST11和ST15型，至于能否利用MALDI-TOF MS區分鑒別攜帶其他碳青霉烯耐藥基因的CRKP和其他型別的CRKP尚無明確定論，但以此為基礎，可以從紹興地區其他醫院擴大樣本量進行更深入的研究，為挖掘出MALDI-TOF MS技術在本地區更多的研究價值提供依據。