創傷性濕肺并發ARDS纖溶患者血清中NF-KB p65表達的分析

張 超,達 晶,楊 智, 楊力濤,賈 永,王軍岐,葛 鵬,沈 鋒

（1.寶雞市中心醫院胸外科，陜西寶雞721008；2.貴州醫科大學附屬醫院胸外科，貴陽550000）

創傷性濕肺是一種肺實質損傷，其致病機理尚不明確，但普遍認為與猛烈的鈍性撞擊相關，包括墜落、車禍等[1]，急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是創傷性濕肺的常見并發癥，主要特點為頑固性低氧血癥，這使得創傷性濕肺并發ARDS 患者的病死率居高不下，該類患者的臨床表現特異性之一是纖溶[2]。有學者分析認為，血液中凝血、抗凝、纖溶三個系統之間的平衡，是血液系統健康與否的關鍵[3]。轉錄因子NF-KB 在人體固有免疫和適應性免疫反應中發揮重要作用，與人體炎癥關系密切。有效分析血NF-KB p65 表達在創傷性濕肺并發ARDS 患者纖溶的影響，可實現上述理論的豐富化，為患者預后改善提供支持。目前相關研究仍有不足，不利于患者的救治，為豐富相關理論，本研究設計對照實驗，采用三組平行對照的方式，在現有理論基礎上，強調不同創傷性濕肺并發ARDS 患者、非ARDS 患者之間的差異評估，研究報道如下：

1.材料與方法

1.1 研究對象 選取寶雞市中心醫院胸外科2017年11月～2018年11月收治的62 例創傷性濕肺并發ARDS 患者為觀察組，男性38 例，女性24例，年齡24 ～71 歲，平均年齡39.2±4.8 歲。另選取同期收治的62 例創傷性濕肺患者為參考組，男性37 例，女性25 例，年齡23 ～71 歲，平均年齡39.4±4.7 歲。選取同期收治的62 例輕微肺部損傷患者為對照組，男性39 例，女性23 例，年齡22～72歲，平均年齡39.3±4.8歲。三組患者的年齡、性別等一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①患者和家屬簽署知情同意書，本研究經院倫理委員會批準；②觀察組患者CT診斷資料和臨床表現，符合創傷性濕肺和《ARDS診斷和治療指南》中的疾病診斷標準[4]；參考組患者CT 診斷資料符合創傷性濕肺的疾病診斷標準[5]；對照組患者CT 診斷資料符合輕微肺部損傷診斷標準[6]。排除標準：①中途退出患者；②已并發多器官功能衰竭，③其他醫院轉入的對象；④其他可能導致血NF-KB p65 表達顯著上升的疾病，如急腹癥、惡性腫瘤、急性冠脈綜合征等。

1.2 試劑與儀器 收集不同患者血樣作為樣本。主要儀器：GelView 6000 化學發光凝膠成像系統，廣州云星儀器有限公司；電泳儀、PCR儀及半干轉膜儀，美國Bio-rad 公 司；普通光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；ThermoVarioskanflash 酶標儀、-80℃冰箱，美國Thermo 公司；低溫離心機，美國IEC公司。主要試劑：NF-kB p65 鼠抗人多克隆抗體（Santa Cruz 公司），PV-9000 免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋公司）。所有血樣制備4 份，三個組別患者的血樣分別進行存放和標記區分。以PBS 作為陰性對照，替代一抗。利用血樣進行血NF-KB p65 表達的分析。應用生化分析儀（URIT-8020）測定患者凝血功能。

1.3 方法 入院時、治療1 周后，對三組纖維蛋白溶解行為進行分析，了解血NF-KB p65 表達的特點。觀察三組凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（FIB）水平變化。采用免疫組化法檢測 NF-kB p65 表達。陽性表達判定[7]：切片由寶雞市中心醫院病理科2 名副主任醫師以雙盲法獨立觀察，在×400 的高倍鏡下每張切片隨機選擇視野10 個，觀察陽性細胞百分比與細胞著色強度。①陽性細胞百分比評分：以陽性細胞百分比＜ 6% 為 0 分，以陽性細胞百分比 6%～26%（包括 6%不包括 26%）為1 分，以陽性細胞百分比26%～51%（包括26%不包括51%）為2 分，以陽性細胞百分比 51% ～ 75%（包括 51% 不包括 75%）為 3 分，以陽性細胞百分比≥ 75% 為 4 分 ；②細胞著色強度 ：以陰性（-）為 0 分，以弱陽性（+） 為 1 分，以中陽性（++）為 2 分，以強陽性（+++）為 3 分。 兩項得分相乘為評分結果 ：以陰性（-）為 0 分至 2 分， 以弱陽性（+）為 3 分至 5 分，以中陽性（++）為 6 分至8 分， 以強陽性（+++）為 9 分至 12 分。

1.4 統計學分析 所用統計學軟件為SpSS21.0。計量資料采用t 檢驗，以均數±標準差（±s）表示；計數資料以χ2檢驗，以率（%）表示。三組之間比較采用F 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 三組纖溶過程中血NF-KB p65 表達特點 入院時，觀察組血NF-KB p65 表達陽性率為98.39%（61/62），參考組為67.74%（42/62），對照組為9.68%（6/62）。觀察組高于參考組（χ2=6.023，P＜0.05）、對照組（χ2=11.276，P＜0.05），參考組高于對照組（χ2=9.120，P＜0.05），差異均有統計學意義。

治療1 周后，觀察組血NF-KB p65 表達陽性率為11.29%（7/62），參考組為9.68%（6/62），對照組為9.68%（6/62）。觀察組與參考組相比（χ2=0.206，P＞0.05）；與對照組相比（χ2=0.206，P＞0.05）； 參考組與對照組相比（χ2=0.062，P＞0.05），差異均無統計學意義。

2.2 三組凝血功能指標比較 見表1。入院時，觀察組FIB 低于參考組、對照組，參考組FIB 低于對照組；觀察組PT, APTT, TT 高于參考組、對照組，參考組PT, APTT, TT 高于對照組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。治療1 周后，三組FIB, PT,APTT , TT 對比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 三組凝血功能比較（n=62）

3 討論

3.1 血NF-KB p65 表達特點 血NF-KB p65 即核因子KB p65，該物質最早為大衛·巴爾提莫發現，核因子KB 是一個蛋白家族，與B 細胞k-輕鏈增強子進行選擇性結合，實現很多基因的呈現、表達[7]。在此前生物實驗中，技術人員在動物細胞中發現NFKB，其典型的表達特征為隨外界刺激增加而加強，二者呈現為典型的正相關[8]。實驗過程中，技術人員以細胞因子、輻射、重金屬、病毒等不同類型的元素進行模擬，當細胞分子的刺激加強后，大鼠體內血KB p65 陽性率由0.6%上升至93%；當輻射刺激加強時，大鼠體內的血KB p65 陽性率由0.6%上升至98%；當重金屬刺激加強時，大鼠體內血KB p65 陽性率由0.6%上升至96%；當病毒刺激加強時，大鼠體內的血KB p65 陽性率由0.6%上升至27%，并在之后的2 天內達到99%，有分析認為血KB p65 陽性率與外界刺激的強弱程度直接相關，相關刺激對機體的影響決定血KB p65 表達結果，一般規律為外界刺激越強，血KB p65 的表達陽性率越強[8]。還有，在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中，血KB p65 也具有重要作用，其錯誤調節可能導致疾病加重[9]。

3.2 創傷性濕肺并發ARDS 患者血NF-KB p65 表達、纖溶的變化 纖溶即纖維蛋白溶解，機體內血液在凝固的過程中，可形成纖維蛋白，其形成與纖維蛋白原數目的活力存在相關性，當血液凝固為血栓或進入高凝狀態下時，又可能重新溶解，這一過程即為纖溶。機體內纖維蛋白一般可維持在一個穩定水平，過高、過低均可能導致機體血液流動情況異常，如纖維蛋白溶解亢進，會導致流血不止；反之可能形成血栓。本研究中，觀察組纖維蛋白原含量低于參考組、對照組，可能原因：觀察組創傷性濕肺并發ARDS 患者纖溶多屬于繼發性纖溶亢進，即凝血酶亢進繼發的纖溶酶亢進，患者出現血凝塊、高凝狀態后，纖維蛋白開始降解，產生D-二聚體等物導致凝血指標出現異常，包括纖維蛋白原含量、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間等變化。影響創傷性濕肺并發ARDS 患者纖溶的因素包括治療因素、機體免疫應答因素、并發癥因素等，其中機體免疫應答與血NF-KB p65 表達具有顯著關聯[10]。

而創傷性濕肺并發ARDS 患者纖溶發生變化，帶有一定的規律性，又存在個體差異，進一步分析則發現：在纖溶過程中，三組患者血NF-KB p65 的表達并不相同，患者病情越嚴重，其纖溶的情況變化越明顯。可能由于創傷性濕肺并發ARDS 患者在嚴重疾病過程中出現肺外或肺內繼發急性滲透性肺水腫和進行性缺氧性呼吸衰竭，還有肺組織損傷的病理和功能改變。而未并發ARDS 的患者僅受到創傷因素影響，加上輕微肺部損傷患者創傷較輕，故這兩組患者的創傷很難對肺組織病理和功能產生較大影響。對于觀察組和參考組患者，此時機體可出現血NF-KB p65 表達變化，基本規律為血NF-KB p65 升高，但隨著積極的治療，1 周后觀察組和參考組患者血NF-KB p65，凝血功能、纖維蛋白原含量恢復正常水平。

3.3 血NF-KB p65 表達對創傷性濕肺并發ARDS患者纖溶的影響機理 創傷性濕肺并發ARDS 患者纖溶受到影響，其中相當一部分創傷組織細胞參與炎性反應、急性排斥反應、細胞增生及凋亡等病理過程。上述過程又會引發一些機體病理改變或者單純的生理變化，典型變化之一是血NF-KB p65 表達的異常。如患者體內的免疫系統受到外界刺激進行免疫應答，其巨噬細胞、中性粒細胞可能在各類免疫因子的影響下出現基因轉錄，表達為i NOS等，導致機體持續產生生理變化。創傷性濕肺并發ARDS 患者體細胞活力并非完全喪失，當這種基因轉錄無法得到控制，可能導致一些內源性的病理變化，使血NF-KB p65 參與到疾病進程中，加劇患者病情[11]。在本文對比研究中發現，創傷性濕肺并發ARDS 患者血NF-KB p65 表達會隨著病情加劇而上升，陽性率接近100%。

本研究，當肺部組織功能因創傷出現下降后，組織內的血液循環首先出現異常，隨著病情變化對機體產生負面影響，如嚴重缺血的組織可能在短時間內壞死，在此過程中，患者體內的血NF-KB p65活力始終處于增強狀態，且不斷活化，缺血位置也可促進血NF-KB p65 表達增強。而纖維蛋白持續溶解與此相關，血NF-KB p65 表達水平的持續增加，是該物質與B 細胞k-輕鏈增強子進行選擇性結合，表現為其表達水平越高，相關結合的速率越快，纖維蛋白的溶解速度也越快。另外，肺部組織細胞本身處于持續分裂狀態中，正常情況下，所有體細胞均處于平衡狀態，血液的抗凝、凝結和纖溶過程是穩定的。而患者發生創傷性濕肺并發ARDS，其尚有活力的體細胞依然在增殖，但血氧供應已不足，血NF-KB p65 大量結合B 細胞k-輕鏈增強子，包括纖維蛋白的溶解在內，機體基因轉錄等活動均受到影響，并發生纖溶功能紊亂，使患者病情加重。如患者僅患創傷性濕肺、無ARDS 病情，其體內血NF-KB p65 表達水平可維持在一個較低的狀態，凝血功能雖然出現變化，但病理變化相對較輕。而在接受有效治療后，上述病情變化得到控制，患者血NF-KB p65 表達、纖維蛋白原含量和凝血功能均可恢復。

此外，在創傷的刺激下，創傷性濕肺并發ARDS 患者可能細胞外基質功能明顯下降，肺部細胞的電荷評估功能衰退，血NF-KB p65 等物質生物活性增加，并通過細胞壁滲透到血管中、組織中，血NF-KB p65 的表達也因此增強[13-16]。本研究中，三組患者血NF-KB p65 與纖溶情況基本符合上述特點，患者病情越重，纖溶過程中血NF-KB p65 陽性率越高。

綜上所述，創傷性濕肺并發ARDS 患者，具有血NF-KB p65 表達升高、纖維蛋白原含量下降、凝血功能異常的特征。血NF-KB p65 表達可作為評析患者肺部疾病進展和危重程度的可靠指標。