國產Auto TRFIA-4型自動熒光免疫分析儀與試劑盒檢測妊娠相關血漿蛋白A的性能評價與參考區間的建立

譚玉華，曹春玲，邢曉敏，周曉姍，謝敬玲，馮健明

（1.廣州市豐華生物工程有限公司體外診斷試劑研發中心，廣州 510730；2.廣東省醫療器械質量監督檢驗所中山檢驗室，廣東中山 528400）

妊娠相關血漿蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是由胎盤合體滋養細胞分泌的大分子糖蛋白，其功能可調節母體免疫系統，保護胎兒免遭排斥。孕早期的PAPP-A 對罹患21-三體綜合征胎兒的識別能力是迄今為止最敏感的孕早期篩查的首選血清標志物。目前，PAPP-A 檢測標準化還面臨許多問題，不同實驗間的檢測結果差異明顯[1]。近年我國實施了PAPP-A 檢測試劑盒醫藥行業標準（簡稱PAPP-A 行業標準）[2]，規范了我國PAPP-A 產品質量，且《醫學實驗室質量和能力認可準則》要求檢驗程序在常規應用前，實驗室需對檢驗程序性能進行獨立驗證，確定檢驗程序的性能特征足以保證其能夠達到臨床檢測所要求[3]。由于產前篩查血清標志物要求靈敏度高、線性范圍寬，并且將中位數及中位數倍數（multiple of median,MOM）應用于血清學產前篩查是一個非常重要的手段，但儀器所配軟件內置初始中位數往往與實際篩查數據并不匹配。時間分辨熒光免疫分析法(time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)作為具有靈敏度高、特異性強和線性范圍寬等特點的第三代標記免疫技術之一，在國內也已經實現了TRFIA的自動化。因此，筆者對國產Auto TRFIA-4 型自動熒光免疫分析儀與試劑盒檢測PAPP-A 進行了性能評價和建立了參考區間，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集了2 519 例孕早期不同孕周的臨床檢測過的孕母血清剩余樣本，用于參考區間的建立，其中孕9 ～ 9+6周314 例，孕10 ～ 10+6周372例，孕11 ～ 11+6周405 例，孕12 ～ 12+6周766 例，孕13 ～ 13+6周662 例。并收集了66 例孕早期不同孕周的臨床檢測過的孕母血清剩余樣本用于方法學比對試驗。

1.2 儀器與試劑 廣州市豐華生物工程有限公司生產的PAPP-A 測定試劑盒（時間分辨熒光免疫分析法）和Auto TRFIA-4 型自動熒光免疫分析儀組成待評價系統。芬蘭Wallac Oy 公司生產的PAPP-A 測定試劑盒（時間分辨熒光法）和AutoDELFIA?1235 型全自動時間分辨熒光免疫分析系統組成的對比系統。低值、中值和高值質量控制品由廣州市豐華生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 檢出限評價：待評價系統重復測定零濃度校準品（校準品A）20 次，計算出反應量（熒光信號值）的平均值(average, x)和標準差（standard deviation,s），將x+2s 的反應量采用同步檢測校準品得到的劑量-反應曲線擬合，計算出相應濃度值為空白限。根據PAPP-A 行業標準[2]要求的檢出限應不高于25 mIU/L，參考PAPP-A 行業標準試驗方法，對5 份近似25 mIU/L 的低值樣本（理論濃度為22.51，22.70，23.18，23.73，24.37mIU/L）進行檢測，每份樣本檢測5 次，對所有檢測結果按照大小進行排序，低于空白限數值的檢測結果的數量應≤3 個。

1.3.2 線性評價：將高值樣本準確稀釋成理論濃度 為9.00，24.00，40.00，200.00，1 000.00 和2 530.00 mIU/L 的6 個梯度。參考PAPP-A 行業標準試驗方法[2]，待評價系統對每一濃度的樣本重復測定2 次，計算其X 作為實測濃度，將實測濃度與理論濃度用最小二乘法進行直線擬合，應至少在覆蓋25.00 ～2 500.00 mIU/L 線性范圍內，線性相關系數（related coefficient,r）≥0.990 0。

1.3.3 精密度評價：參考PAPP-A 行業標準試驗方法[2]，待評價系統采用同一批號國產試劑盒，在一次實驗中分別平行測定高、中、低三種不同濃度的質量控制品各10 次，計算測定結果的x 與s，其批內變異系數（coefficient of variation,CV）應不超過10.0%。待評價系統采用三批國產試劑盒分別測定同一批次低、中、高值質量控制品，每批試劑盒各測10 孔，計算30 次測定結果的x 與s，3 個批號國產試劑盒的批間CV 應不超過15.0%。

1.3.4 準確度評價：參考PAPP-A 行業標準中的方法學比對試驗[2]，待評價系統和對比系統平行檢測66 例不同濃度的孕婦血清樣本，每個樣本測定1 次（樣本均先按試劑盒說明書稀釋5 倍后檢測，得到的結果乘以5 后為樣本的原始濃度），采用線性回歸方法對兩組結果進行線性擬合，PAPP-A行業標準要求兩組結果的r 應不小于0.950，斜率應在0.9 ～ 1.1 內。并利用回歸方程進行偏差估計，以預期偏差滿足國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質量評價標準（PAPP-A 靶值±30%）為接受標準。

1.3.5 參考區間建立：參考C28-A2 要求[4]，待評價系統檢測孕期在9 ～ 13+6周的2 519 例孕母血清樣本，建立PAPP-A 的參考區間。

1.4 統計學分析 采用Excel 2007 軟件進行統計處理。計量資料以±s 表示；線性回歸采用最小二乘法進行分析，并對r 采用t 檢驗，tr＞ t0.05（v），P＜0.05，認為2 個變量間具有相關性，r 的絕對值大于0.7，則表示2 個變量高度相關；r 的絕對值大于0.4，≤0.7 時，則表示2 個變量中度相關；r 的絕對值大于0.2，≤0.4 時，則表示2 個變量低度相關；2 組配對樣本定量結果的差異采用t 檢驗，t ＜t0.05（v），P ＞ 0.05，表明差異無統計學意義。不同孕周PAPP-A 的參考區間計算，采用第5 和95 的百分位數表示，并計算其中位數。

2 結果

2.1 檢出限 見表1。待評價系統重復測定零濃度校準品20 次的反應量的x 為943.15，s 為15.78，x+2s 為974.71，采用同步檢測校準品得到的劑量-反應曲線擬合，得到相應濃度值為0.50 mIU/L，即為空白限。5 份近似25 mIU/L 的低值樣本檢測結果均未低于空白限。

表1 待評價系統檢測PAPP-A 低值樣本的結果

2.2 線性 見 圖1。在9.00 ～2 530.00 mIU/L 范圍內，實測濃度與理論濃度的線性回歸方程為Y=0.998 0X+6.061 7，r=0.999 6，實測濃度與理論濃度呈高度正相關（tr=86.59, P＜0.05）。

圖1 待評價系統檢測PAPP-A 的線性評價

2.3 精密度 見表2。待評價系統檢測低值、中值和高值PAPP-A 質量控制品的批內CV 分別為2.86%，2.34%和2.80%；批間CV 分別為3.02%，2.98%和3.48%。

2.4 準確度 待評價系統和對比系統平行檢測66 例孕母血清樣本的濃度結果差異無統計學意義（t=1.10，P ＞ 0.05），兩組數據的線性回歸方程為Y=0.937 3X+270.15，r=0.993 2，呈高度正相關（tr=96.68, P ＜0.05），結果見圖2。采用回歸方程進行偏差估計，當孕母血清樣本PAPP-A 濃度＞745 mIU/L 時，預期偏差均在靶值±30%范圍內。

表2 待評價系統的精密度評價結果

圖2 待評價系統和對比系統檢測PAPP-A 結果的線性回歸分析

2.5 參考區間 見表3。待評價系統檢測了9 ～ 13+6周 的2 519 例孕母血清 中 的PAPP-A，在9 ～ 9+6，10 ～ 10+6，11 ～ 11+6，12 ～ 12+6和13 ～ 13+6孕 周 的PAPP-A 中位數分別為 977，1 550，2 536，3 683和5 393 mIU/L。

表3 待評價系統檢測PAPP-A 的參考區間

3 討論

檢測系統在用于實際檢測臨床樣本、發出檢驗報告前，實驗室必須在檢測系統最佳穩定狀態下使用，對檢測系統的分析性能予以證實。血清學產前篩查對血清標志物檢測結果有較高的準確度和精密度要求，實驗室需要使用符合要求的檢測產品。本研究參考PAPP-A 行業標準對Auto TRFIA-4 型自動熒光免疫分析儀和試劑盒檢測PAPP-A 進行了性能評價，空白限達到0.50 mIU/L，檢測限符合PAPP-A 行業標準要求；線性范圍達9.00～2 530.00 mIU/L，較PAPP-A 行業標準要求的線性范圍寬，其r 達到0.999 6；檢測PAPP-A 的批內CV 小于3%，批間CV 小于4%，精密度優于PAPP-A 行業標準的要求，在加拿大的技術規范中要求檢測PAPP-A的CV 不超過10%[5]，我國頒布的孕中期產前篩查技術標準要求的產前篩查血清標志物批內CV 小于3%，批間CV 小于5%[6]；方法學比對試驗為準確度評價的方法之一，待評價系統和對比系統檢測PAPP-A 結果采用線性回歸方程分析，斜率為0.937 3，r 為0.993 2，符合PAPP-A 行業標準的要求，且兩系統檢測的PAPP-A 濃度結果差異無統計學意義（t=1.10, P＞0.05）。采用回歸方程進行偏差估計，當孕母血清樣本PAPP-A 濃度大于745 mIU/L 時，預期偏差均在國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質量評價標準（PAPP-A 靶值±30%）范圍內。本研究參考C28-A2 要求[4]，建立了待評價系統檢測PAPP-A 的中位數，與高剛[7]等報道的臨沂地區8 426 例孕婦9 ～ 13+6周的PAPP-A 中位數比較，平均高18.38%，可能與不同檢測系統、不同地區受檢人群和入選樣本例數差異有關，蔣濤等[8]也曾報道了2 個不同地區的PAPP-A 中位數偏差平均可達14.3%，因此實驗室應積累一定數據后，根據本地數據建立自己的中位數，而后將所有實際測定值的濃度轉化為MOM 來表達，再使用標化后的MOM值對篩查疾病進行風險評估。

綜上所述，國產Auto TRFIA-4 型自動熒光免疫分析儀和試劑盒檢測PAPP-A 的性能符合PAPP-A 行業標準的要求，建立的PAPP-A 參考區間以供臨床參考。