62株臨床分離布魯氏菌對四種常用抗生素藥物敏感性實驗

梁英風,吳金英,劉 巖,伊茂禮,周志美

(煙臺毓璜頂醫院a.檢驗科；b.感染科， 山東煙臺 264000）

布魯氏菌病是由布魯氏桿菌引起的一種急性或慢性動物源性傳染病，屬自然疫源性疾病。該病是我國《傳染病防治法》規定的乙類傳染病，可造成嚴重的健康和社會經濟損失。全球有近170 個國家和地區的人畜中存在布魯氏菌病，且成為自90年代中期起報告發病率上升最快的傳染病之一[1]。近年來，我國由于牧區分布范圍廣泛，變化趨勢體現為由牧區向半牧半農區甚至農區轉化，由聚集暴發向散在發病轉化。由于布魯氏菌病起病隱匿，且臨床癥狀廣泛多樣(如發熱乏力、關節肌肉疼痛、肝脾腫大等)［2］，給臨床診斷治療帶來極大挑戰，為了使患者得到及時正確的診斷和規范性治療，現將我院2015～2018年微生物實驗室分離出的布魯氏菌體外藥敏試驗結果分析如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2015年2月～2018年12月我院各臨床科室送檢的血培養中共分離出62 株布魯氏菌, 其中呼吸科23 例，關節脊柱科11 例，血液內科9 例，風濕免疫科8 例，消化內科6 例，其余科室共5 例。男性43 例，女性19 例。經查病歷發現，62 例病人均有不同程度的發熱，最高體溫為37.3℃～40.1℃，平均38.7℃。24 例患者有典型的波狀熱，9 例有弛張熱，29 例有不規則發熱。所有的病患均有不同程度的關節肌肉疼痛。39 例病程小于1 個月，14 例病程3 個月左右，9 例病程超過3個月。在62 例患者中，36 例有接觸牛和/或羊的病史，9 例常吃牛羊肉，5 例喝過羊奶，4 例為廚師，2 例從事生羊皮加工，6 例病史不詳。WBC 計數（2.22～14.31）×109/ml，紅細胞沉降率大多介于15～61mm/h，4 例在15mm/h 以下。

1.2 試劑與儀器 Bact/Alert 3D 自動血培養儀、VITEK-2Compact 自動細菌分析儀、革蘭氏陰性桿菌鑒定卡（GN,法國生物梅里埃公司）、慶大霉素（GEN）、利福平(RIF)、復方新諾明（SXT）、多西環素（DOX）E-test 試驗紙片（溫州康泰生物科技有限公司），血瓊脂平板、M-H 瓊脂平板（濟南百博生物）。

1.3 方法

1.3.1 細菌的培養與鑒定：血液經Bact/Alert 3D 自動血培養儀培養報陽后，查看報警曲線，立即用無菌注射器抽取瓶中液體涂片，同時轉鐘血瓊脂平板置于35℃，5%（v/v）CO2溫箱中培養。革蘭染色后鏡下可見革蘭陰性短小球桿菌，著色較弱，菌體排列如細沙樣團狀，培養48h 后血平板可見圓形細小菌落，表面光滑稍隆起，呈灰白色。獲得的純培養細菌用VITEK Ⅱ自動細菌分析儀來鑒別菌種。

1.3.2 藥物敏感性及判斷標準：布魯氏菌屬的藥敏試驗沒有擴散法的折點標準，常用藥稀釋法折點標準為慶大霉素：≤4μg/ml 為敏感，多西環素：≤1μg/ml 為敏感，復方新諾明：≤2/38μg/ml 為敏感，利福平暫無敏感標準。本試驗中菌株的MIC是用E-test 試驗方法測得。將0.5 麥氏單位的菌液涂布在血M-H 瓊脂平板上，5 min 后貼藥敏紙片。室溫放置10min 后，將平板放置于35℃溫箱培養24h。抑菌率根據CLSI M100-22 標準（非腸桿菌科細菌的MIC 值解釋標準）得出，由于布魯氏桿菌的致病性及以往實驗室感染的報道，我們實驗室醫務人員均穿防護服，佩戴口罩、手套，所有標本操作都在二級以上的生物安全柜內進行。

1.3.3 診斷標準：衛生部地方病防治司頒布的布氏桿菌病診斷標準規定，有流行病學接觸史，符合布魯氏菌病臨床癥狀和體征，同時血清凝集試驗、補體結合試驗及抗人球蛋白試驗任一項陽性者即可確定為布魯氏菌病患者［3］。

2 結果

2.1 細菌的生長特點和菌株鑒定 62 例血培養平均報警時間是42.7h，最短29.3h，最長57.9h。轉種的血平板于35℃溫箱培養48h 后，可見圓形，突起，乳白色，濕潤的不溶血菌落，菌落大小1～2mm。革蘭染色呈革蘭陰性短小球桿菌，細小，分布如沙灘狀。VITEK Ⅱ自動細菌分析儀鑒定結果均為馬耳他布魯氏菌。

2.2 MIC 值藥敏試驗結果 經測定，慶大霉素MIC 值 為0.5～0.75μg/ml，其 中0.5μg/ml 27 例，0.75μg/ml 35 例；利福平MIC 值為0.06～2μg/ml，其 中0.06μg/ml 21 例，0.75μg/ml 16 例，2μg/ml 25 例；復方新諾明MIC 值為4 ～16μg/ml，其中4μg/ml 27 例，8μg/ml 21 例，16μg/ml 14 例； 多西 環 素MIC 值 為8 ～32μg/ml，其 中8μg/ml 26例，16μg/ml 22 例，32μg/ml 14 例。四種抗生素MIC50，MIC90 值及敏感率見表1。

表1 62 株布魯氏菌四種抗生素MIC50，MIC90 值（μg/ml）及敏感率

3 討論

布魯氏菌感染劑量很低，可使被感染的雌性動物流產，牛、羊、豬是布魯氏菌最易感的動物。被感染的動物持續排菌，通過分泌物和排泄物（牛奶、精液、陰道分泌物、糞便和尿液）排出。病原體可通過體表皮膚黏膜、消化道、呼吸道等侵入人體引起布魯氏菌病。人的感染途徑與職業、飲食和生活習慣有關［4］。近年來，布魯氏菌病在人類和動物間的傳播有明顯上升趨勢。由于布魯氏菌為胞內寄生菌，可侵入許多臟器，而抗生素和抗體又很難進入細胞內，這就使得布魯氏菌病的治愈非常困難。

布魯氏菌病根據病程可以分為急性期（6 個月以內）和慢性期（超過6 個月）［1］。急性布魯氏菌病能引起系統性網狀內皮細胞增生，常伴有化膿及神經、循環和生殖等系統的損傷，尤其是骨關節系統的損害。然而，慢性期的特點是組織細胞增生和肉芽組織形成。在一些病人中，肉芽組織發生纖維硬化是后遺癥產生的基礎［5］。

本次試驗中，慶大霉素和利福平均屬于抗生素，其中利福平殺菌機制為阻斷細菌RNA 和蛋白質的合成，對細胞內外的細菌均有明顯的殺菌效果［6］，而本實驗中RIF 的MIC 值在低水平有較好的殺菌活性。利福平長期以來被視為治療布魯氏菌病的首選藥，而且它的臨床治療總體上是安全的，但是考慮到藥物的毒副作用，如骨髓抑制、肝功能損傷、胃腸反應等，可暫緩使用或改用其他可替代的藥物或聯合用藥治療。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗菌藥物，也有較高的殺菌活性，但是他們用于治療布魯氏菌病的報道很少。多西環素的MIC 值在62 例菌株中均超過8μg/ml，最高達32μg/ml，這與幾年前的報道一致［7］，且不良反應最少，聯合用藥時會權衡進行選擇。復方新諾明的殺菌率較低，根據抗菌活性它不能單獨作為布魯氏菌病的治療用藥。

此次研究的62 例馬耳他布魯氏菌病患者，在被診斷為布魯氏菌病后接受了口服利福平和多西環素，隨后即被轉往傳染病醫院進行進一步治療。經隨訪在用藥2 周后，大部分病人有不同程度的好轉，另有12 例因聯系方式有誤等原因未聯系到病人，無法對其進行追蹤與隨訪，他們的治療進展無從而知。對布魯氏菌病治療的失敗，除細菌本身的特性外，還有一個重要原因就是選藥不當或療程不足所致。布魯氏菌病的治療可參考衛健委印發的布魯氏菌病診療指南［7］，基本原則是：早期、聯合、足量、足療程用藥。為減少復發和防止耐藥菌株的產生，一般聯合兩種抗生素治療2～3 個療程。無并發癥的非復雜性感染臨床常用的抗生素物組合為：多西環素（6 周）+慶大霉素（1 周）、多西環素（6周）+利福平（6 周）或多西環素（6 周）+鏈霉素（2 ～3 周）等［1］。復發病例多因藥物治療依從性差，未滿療程停藥，而非耐藥菌的產生，可用原方案再治療1 個療程。無論何種治療方案，治療過程中要注意監測患者血細胞檢測、肝腎功能等。我國是抗生素應用大國，耐藥性問題不容忽視，國外有文獻報道，布魯氏桿菌對利福平的敏感性降低［9］，我國尚無耐藥性研究，有待較大規模的調查以明確我國布魯氏菌的耐藥現狀。為了使患者早日康復，臨床醫生應該根據個體差異和藥物敏感試驗結果，合理靈活地選擇抗生素。

本文不足之處，由于本院為本地區較大的綜合型醫院，確定患者來源較為困難，無法判斷不同區域患者之間藥物敏感性是否存在差異，同時因確診布魯氏菌病后患者均被轉到當地傳染病醫院，對聯系方式有誤的患者無法對其后續治療進一步隨訪，因此對病程和治療結果無法得知。如果能夠完善患者信息，加強不同區域流行病學調查和宣傳教育，相信對進一步降低布魯氏菌病的發病率大有幫助。