三種質譜儀測定血液環孢素A濃度性能確證和優選研究

王 磊,趙 穎,劉紅星,2

（1.河北燕達陸道培醫院,河北三河 065201；2.北京陸道培血液病研究院，北京 100176）

環孢素A（cyclosporine A,CsA）是由11 個氨基酸水合而成的親脂性環狀多肽，是一種具有高選擇性的強效免疫抑制劑，為拮抗臨床器官和組織移植后排異反應的首選藥物[1]。在骨髓移植患者中，主要用于骨髓移植排異和移植物抗宿主反應（graft versus host reaction,GVHD）的預防和治療[1-6]，其使用周期長，應用頻率高，但其具有治療窗窄，個體差異大，須進行血藥濃度監測[2-7]。目前，CsA 血藥濃度測定方法主要有免疫法（EIA，EMIT，MEIA，CMIA，Elecsys 等）、色譜法及質譜法[2-15]。由于免疫法易產生交叉反應，導致結果偏離，同時其試劑價格昂貴；色譜法分析時間長，限制了大樣本的臨床檢測對血藥濃度檢測及時性的要求，因此質譜法檢測CsA 血藥濃度越來越受到廣大實驗室的 。因此，本文根據臨床需求結合醫院實際情況，在實驗室現有三臺不同型號質譜儀（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD）上分別進行CsA 血藥濃度測定的方法學性能確證[16-20]，找出CsA 血藥濃度測定在實驗室現有哪款質譜儀上性能更穩定，檢測更方便，且更適合大批量臨床樣本檢測。通過臨床實際樣本檢測進一步確認同一批樣本分別在三臺質譜儀上檢測結果之間差異是否有統計學意義，優選出合適的質譜儀用于CsA 血藥濃度測定。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年11月24日～ 25日送河北燕達陸道培醫院藥理室檢測CsA 血藥濃度的新鮮剩余全血樣本，共100 份。要求血樣無黃疸、無乳糜、無溶血及凝血，樣本剩余全血量不小于2ml。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 ：TRIPLE QUADTM 4500 MD 質 譜儀（美國Sciex 公司），Jasper 高效液相色譜儀，4000 Q TRAP質譜儀（美 國AB Sciex 公 司），島津 20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），API 3200 MD 質譜儀（美國AB sciex 公司），島津Nexera Xp 型高效液相色譜儀（日本島津公司）。其它儀器有渦旋振蕩器，離心機等。

1.2.2 試 劑：ClinCal?-Calibrator（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)，ClinChek?-Control（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)；CsA 測定試劑盒（紅細胞裂解液和CsA-d4 內標液及CsA 標準液；批號20191111，江蘇豪思生物科技有限公司）。甲醇為色譜純（Fisher）,水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏），甲酸為色譜純（Fisher），乙酸銨（AR，MREDA TECHNOLOGY INC）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱Ultimate XB-C18 色譜柱（4.6mm×50mm，5μm），柱溫60℃；流速0.8ml/min；流動相：2mmol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水溶液（B）-0.1%甲酸甲醇溶液（A）。

表1 不同質譜儀上的色譜條件

1.3.2 質譜條件：采用電噴霧電離源（ESI+）； MRM；碰撞氣：Medium。

表2 三臺質譜儀的主要質譜參數

1.3.3 前處理方法：精密吸取100μl 全血置于1.5ml EP 管中，然后依次加入紅細胞裂解液100μl，CsA-d4 內標液300μl，渦旋震蕩1.0min，13 000r/min離心8min，取上清液150μl于自動進樣器，待檢。ClinCal?-Calibrator 和ClinChek?-Control 處理方法同上。

1.3.4 性能確證[16-20]

1.3.4.1 方法學考察：在上述色譜質譜條件下，取空白全血100μl，用300μl 的50%甲醇代替內標液，按照“1.3.3”項下處理；另取100μl 空白全血加一定量CsA 標準液，余下按照“1.3.3”項下處理；另取100μl 患者樣品全血按照“1.3.3”項下處理方法處理。根據三組樣品的出峰情況，對本實驗的方法學進行考察。

1.3.4.2 標準曲線制備：分別在7 個1.5ml 的EP 管中加入100μl ClinCal?-Calibrator各系列校準工作液，按“1.3.3”處理后進行檢測，用加權（W=1/X2）最小二乘法以CsA 峰面積與CsA-d4 峰面積比值為(Y)對CsA 濃度（X）進行線性回歸，得CsA 標準曲線。以平均信噪比（S/N）為3 的濃度作為方法的最低檢測線（limit of detection，LOD），以平均信噪比（S/N）為10 的濃度作為方法的最低定量線（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.4.3 精密度和正確度：按“1.3.3”樣品處理辦法，對ClinChek?-Control 每一濃度平行制備6 個樣本分析，連續測定3 天，根據測得結果計算日內及日間精密度和回收率。

1.3.4.4 殘留和基質效應：通過分析高濃度樣品或校準曲線最高點濃度樣品后，立即測定空白樣品來評價方法殘留，測定空白基質樣品中的CsA 和內標CsA-d4 的峰面積，以確認殘留對CsA 準確定量的影響；基質效應是通過評價CsA 在有無全血基質中的信號值強弱來實現的，分別添加3 個濃度水平的CsA ClinChek?-Control 質控溶液到全血基質和純溶劑，按照“1.3.3”樣品處理辦法處理，通過比較全血存在下CsA 及CsA-d4 的信號強度與不含全血CsA 及CsA-d4 的信號強度，通過內標歸一化的基質因子(IS-normalized MF)來評價基質效應，計算公式如下：

IS-normalized MF =（基質存在下CsA 峰 面積/CsA-d4 面積）/（基質不存在下CsA 峰面積/CsA-d4 峰面積）

1.3.4.5 穩定性：由于CsA 血藥濃度檢測要求及時性，故對ClinChek?-Control 低、中、高濃度樣品分別進行室溫放置24h 后分析，4℃冰箱放置24h 后分析，每個濃度五份樣品，按照“1.3.3”項下進行ClinChek?-Control 質控品處理。如果重復性測定的偏倚不超過±15%，則樣品的穩定性符合實驗室臨床檢測的要求。

1.4 統計學分析 收集的100 份患者CsA 血藥濃度剩余全血樣本，按“1.3.3”項下處理，分別在三臺質譜儀上檢測其CsA 濃度。使用SPSS 17.0 對三臺儀器檢測結果進行方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。同時對三臺儀器檢測結果進行相關性分析。

2 結果

2.1 方法學考察結果 見圖1。在選用條件下，全血中內源性物質不干擾CsA 和CsA-d4 的測定，CsA 在TRIPLE QUADTM 4500 MD，4000 Q TRAP和API 3200 MD出峰時間分別為1.95，1.95 和1.99min，各峰型良好，CsA-d4 與CsA 保持一致。TRIPLE QUADTM 4500 MD 和4000 Q TRAP 每針檢測時間為3min；API 3200 MD 每針檢測時間為4min，耗時較長，檢測速度慢。

圖1 方法學考察（A，B，C）

2.2 標準曲線 見表3。表明CsA 在濃度區間（26.4 ng/ml ～ 1 290 ng/ml）內，在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 質譜儀上的線性關系良好，均可用于定量；其LOD 分別為0.5，0.2，0.6 ng/ml；其LQD 分別為1.7，0.7，2.1 ng/ml。

表3 不同型號質譜儀標準曲線結果

2.3 精密度和準確度 見表4。CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD上的相對標準偏差均較小（＜5%），精密度好，回收率高(＞90%)，準確度好。說明此三臺質譜儀上的CsA 檢測方法均能滿足患者CsA 血藥濃度監測對精密度和準確度的要求。

表4 三臺質譜儀精密度與準確度結果

2.4 殘留、基質響應結果 殘留結果見表5，CsA和 內 標CsA-d4 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三臺質譜儀上殘留結果均小于5%，符合中國藥典藥品生物樣品定量分析方法驗證指導原則[16]。

基質效應結果見表6，表明有全血、無全血基質中加入不同濃度CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三 臺 質 譜 儀上的IS-normalized MF 分別為94.96%～ 106.02%，88.96% ～ 95.47%和99.14%～ 107.82%，偏倚（CV）均小于15%，說明內標與分析物的基質效應接近，可以補償樣品中分析物可能出現的基質效應，基質效應評價符合中國藥典藥品質量標準分析方法驗證指導原則[16]。

表5 三臺質譜儀殘留結果

表6 三臺質譜儀基質效應結果（%）

2.5 穩定性結果 低、中、高濃度質控品分別進行室溫放置24h，4℃冰箱放置24h 穩定性實驗（n=5），在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三臺質譜儀上重復測定的偏倚(CV)均小于15%，穩定性數據符合要求；但根據實驗數據可知，樣本4℃冰箱放置其結果偏倚更小，更穩定，在實際操作中更可行。

表7 三臺質譜儀穩定性結果（n=5）

2.6 臨床應用 隨機收集2019年11月24日～25日的環孢素樣本100 份，并分別在三臺質譜儀上進行檢測，其中CsA 血藥濃度結果小于100 的占比58%，結果大于100 并小于300 的占比42%。其方差分析結果為F=0.409，P=0.665＞0.05，說明TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP，API 3200 MD 三種方法檢測結果差異均無統計學意義。同時，TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP相關系數為0.994 0，4000 Q TRAP 與API 3200 MD樣本結果相關系數為0.996 9，TRIPLE QUADTM4500 MD 與API 3200 MD 相關系數為0.995 9,說明三臺質譜儀檢測結果相關性較好，無需換算可直接進行互相轉換，供臨床參考。見圖2。

圖2 相關性分析

3 討論

CsA 作為環狀多肽類免疫抑制劑，主要用于臨床GVHD 的預防和治療。由于其分子量較大，代謝產物種類較多，且代謝產物含量各異[1-11]。因此，其血藥濃度受不同檢測方法影響較大[2-5,7-10]。用免疫法檢測，其代謝產物和結構類似物容易與CsA 發生免疫交叉反應，導致CsA 血藥濃度檢測結果偏高或偏低；同時又由于CsA 代謝產物活性不同，導致CsA 血藥濃度結果與臨床現象不符，對CsA 血藥濃度監測，方法的選擇就顯得尤為重要。DAVID W.Holt等[11]人認為色譜法作為CsA 血藥濃度測定的金標準，質譜檢測具有更高的靈敏度和選擇性。2002年澳大利亞的專家共識指出CsA 血藥濃度測定可以選擇免疫法（EMIT，ACMIA）或者是色譜法和質譜法，同時指出隨著質譜儀的普及，質譜法檢測CsA血藥濃度將成為趨勢[12]。2009年WHO 指出CsA血藥濃度測定應選擇特異性強的檢測方法，避免代謝產物的干擾[13]。同時西雅圖標準中也指出CsA血藥濃度選擇高效液相色譜串聯質譜測定且梅奧診所也采用高效液相色譜串聯質譜來測定免疫抑制劑的血藥濃度[14]。2019年，中國治療藥物監測專家共識指出，從藥物專屬性上推薦采用液相色譜-質譜聯用技術和高效液相色譜技術用于藥物血藥濃度測定[15]。本文選擇質譜法檢測CsA 血藥濃度，是基于色譜法作為CsA 血藥濃度監測的金標準而進行的，通過確定的質量數特異性監測CsA，進而定量，其不受代謝產物和結構類似物的干擾，用于檢測CsA 母體藥物。

由于本實驗擁有三臺質譜儀（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAPAPI 與3200 MD），不同儀器間用于檢測骨髓移植患者CsA 血藥濃度是否存在差異以及哪臺儀器更適合的問題，一直困擾實驗室。本試驗主要對以上三種不同型號質譜儀進行CsA 血藥濃度進行性能驗證，以明確哪一種型號質譜儀更加適合CsA 血藥濃度監測，主要通過標準曲線，日內、日間精密度，殘留，基質效應，穩定性這幾方面進行驗證[15-20]。有以上結果可見，API 3200 MD 檢測時間長，進樣量大，質譜儀易受污染。本實驗室前期預實驗也發現API 3200 MD 對色譜梯度洗脫方法要求很嚴格，其影響檢測穩定性因素較多。而TRIPLE QUADTM 4500 MD 與4000 Q TRAP 檢測時間短，進樣量小，其方法較穩定。但由于其價格較高，尚不能廣泛使用。而API 3200 MD 和TRIPLE QUADTM4500 MD均獲得CFDA批準，可以用于臨床實驗室檢測。整體結果表明TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP 和API 3200 MD 相比，更適合于CsA 血藥濃度監測。希望基于本試驗的結果對臨床如何選擇質譜儀監測CsA 血藥濃度提供參考，以便更好地實現個體化、合理化用藥[2-5,9-12]。