不同連作年限高粱生長及根際土壤微生物群落功能多樣性差異

王 磊，樊芳芳，白文斌，聶萌恩，江佰陽，王勁松，武愛蓮，郭 珺

（1.山西農業大學高粱研究所，高粱遺傳與種質創新山西省重點實驗室，山西晉中030600；2.山西農業大學資源環境學院，山西太原030031）

高粱（Sorghum bicolorL.Moench）是世界上第 五大谷類作物，具有多重抗逆性[1]，是一種重要的旱地雜糧作物，也是山西老陳醋和汾酒的主要釀造原料，受到鐮刀灣種植結構調整拉動，高粱成為山西旱作農業可持續發展的重要作物[2]。連作都會導致植物病原體富集，土壤微生態環境惡化[3]，最終降低作物產量[4]。隨著高粱訂單農業的發展，種植企業為追求經濟效益，長期高強度連續種植高粱，出現連作障礙現象。因此，高粱連作障礙成為制約山西省高粱可持續發展的關鍵問題。

根際是植物與土壤細菌和真菌共生的特殊微生態環境，植物根系分泌物可選擇性地促進或抑制特定微生物類群[5]，土壤微生物類群的變化會影響土壤微生態功能的改變[6]。近年來，有學者研究認為，根際微生態系統的失衡是造成連作障礙發生的主要原因[7-8]。植物根際微生物群落較為敏感和迅速地反映根際環境條件的變化，是根際微生態的重要組成部分[9]，因此，研究連作根際土壤微生物的變化規律很有必要。鄒春嬌等[10]對不同連作年限黃瓜基質微生物群落結構多樣性研究發現，在連作5茬時，栽培基質中微生物碳代謝活性、功能多樣性均高于各茬，但在連作11茬后，基質中微生物碳代謝活性、功能多樣性均顯著降低，但對羧酸類碳源的代謝明顯升高。秦舒浩等[11]對馬鈴薯連作障礙的研究發現，隨連作年限不同，馬鈴薯連作根際土壤微生物群落結構代謝多樣性及遺傳多樣性發生改變，但不同作物在不同連作年限條件下土壤微生物群落結構變化特征有所差異[12]。已有研究表明，連作導致高粱長勢及產量降低，連作根際土壤真菌富集，土壤微生態環境惡化[3，13-14]。但目前不同連作年限條件下，連作高粱根際土壤微生物群落結構變化的相關研究國內外尚未見報道。

本研究以高粱連作根際土壤為研究對象，采用BIOLOG-ECO板對根際土壤微生物群落的碳源代謝功能進行分析，從功能多樣性角度揭示了高粱根際土壤微生物群落變化，以期為深入研究高粱根際土壤生態功能及高粱連作障礙機制提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

本試驗于2017年4—7月在山西省農業科學院連棟溫室內進行，采用盆栽試驗方法，供試土壤采集于山西省農業科學院試驗基地高粱連作5 a田、高粱連作10 a田、高粱玉米輪作田，多點采集耕作層0～20 cm土壤并充分混勻。盆栽土的基礎理化性質如下：pH＝8.40，有機質14.16 g/kg，全氮0.98 g/kg，速效磷8.17 mg/kg，速效鉀259.82 mg/kg。

1.2 試驗材料

供試高粱品種為山西省農業科學院高粱研究所選育的晉雜34號。

1.3 試驗設計

盆栽試驗設置3個處理：C5（高粱連作5 a）、C10（高粱連作10 a）、CK（高粱玉米輪作）；每處理設置6個重復，共18盆。每盆裝土5 kg（盆高18 cm，盆內徑21 cm），裝盆前將肥料與不同處理土壤充分混勻（施N肥0.2 g/kg，P肥0.15 g/kg，K肥0.15 g/kg），播種前將種子催芽，每盆播20粒，留苗4株到抽穗期。在出苗60 d后破壞性取土樣，抖根法[15]采集高粱根際土壤，根際土壤去除雜質后立即保存于-80℃，用于測定微生物功能多樣性。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 作物生長參數的測定 在出苗后60 d，破壞性采集高粱植株樣本，測定高粱株高、莖粗，并烘干測其生物量。

1.4.2 土壤微生物群落結構的測定 土壤微生物功能多樣性使用BIOLOG-ECO微平板法測定[16]。稱取相當于10 g干土質量的根際土壤加入100 mL滅菌的NaCl溶液（0.85% ）中，得到10-1土壤浸提液；200 r/min旋渦振蕩30 min；靜置片刻后梯度稀釋到10-3土壤浸提液，土壤按照每孔150μL加入ECO板，加蓋放置于28℃的培養箱中培養至168 h，每隔24 h在590 nm下測定吸光值（Biolog Reader 4.2）。每孔平均顏色變化率（AWCD）[17]用于描述土壤微生物代謝活性，BIOLOG-ECO板的31種碳源可分為六大類，即碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類，計算每類碳源對應孔吸光值的平均值，用來表征微生物群落對該類碳源的代謝活性；McIntosh指數（U）、Shannon-Wiener指數（H）為分別用于描述土壤微生物群落均勻度及豐富度的指數[18]。

式中，Ci為第i孔的吸光值，R為空白孔的吸光值。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2013進行數據整理；用BIOLOG-ECO板培養96 h的數據進行分類碳源利用及主成分分析，采用SPSS 17.0進行不同處理間數據的方差分析及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同連作年限對高粱生長的影響

由表1可知，與CK相比，C5和C10顯著抑制了高粱的生長，C5處理高粱的株高、莖粗和生物量分別比CK降低了10.18% 、15.73% 、14.62% ，差異達顯著水平（P＜0.05），C10處理高粱的株高、莖粗和生物量分別比CK降低了21.28% 、15.73% 、28.46% ，差異達顯著水平（P＜0.05）；比較不同連作年限條件下高粱生長特征可知，C10對高粱生長的抑制作用比C5的抑制作用更大，C10高粱長勢最弱。由此可得，連作顯著抑制高粱生長，連作10 a對高粱的抑制作用大于連作5 a。

表1不同連作年限高粱的生長情況

2.2 不同連作年限對高粱根際土壤微生物代謝活性及功能多樣性的影響

AWCD（每孔平均顏色變化率）反映土壤微生物對31種碳源的平均利用能力，可表征高粱根際土壤微生物群落的代謝活性。隨著培養時間的延長，根際微生物對碳源代謝能力逐漸增加，到168 h時逐漸趨于平緩，在培養過程中，C10的AWCD值均顯著高于C5和CK處理，而C5的AWCD值低于CK處理（圖1）。在培養96 h時，C10的AWCD值分別是C5和CK的2.05倍、1.47倍（P＜0.05），C5的AWCD值比CK降低了28.57% （P＜0.05）（表2）。這表明，連作5 a降低了高粱根際土壤微生物代謝活性，而連作10 a增加了根際土壤微生物的代謝活性。

表2不同連作年限高粱根際土壤微生物群落的功能多樣性指數

對培養96 h數據進行碳源代謝多樣性分析，結果 顯 示，C10的McIntosh指 數 分 別 是C5、CK的2.08倍、1.45倍（P＜0.05），Shannon多樣性指數分別比C5、CK處理增加了2.74% 、4.17% （P＜0.05）。C5的McIntosh指 數比CK降低 了30.15% （P＜0.05），但C5的Shannon多樣性指數與CK相比差異不顯著。這表明連作10 a高粱根際土壤微生物群落對碳源代謝的多樣性及均勻性顯著增加，但連作5 a時高粱根際土壤微生物群落代謝活性及代謝均勻性降低，但代謝碳源的多樣性差異不大（表2）。

2.3 不同連作年限對高粱根際土壤微生物群落分類碳源代謝活性的影響

根據官能團的不同，可將BIOLOG-ECO板的31種碳源分為6大類，C10對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類的代謝分別是CK的1.63倍、1.53倍、2.62倍，差異達顯著水平（P＜0.05），而C10對多聚物類、酚酸類、胺類的代謝與CK處理差異不顯著。與CK相比，C5對碳水化合物類、氨基酸類、多聚物類、酚酸類、胺類的代謝均顯著降低，而C5對羧酸類的代謝比CK顯著增加，其對羧酸的代謝活性是CK的2.48倍（P＜0.05）。這表明，連作10 a增加了高粱根際微生物對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類的利用能力，而連作5 a增加了高粱根際微生物對羧酸類的利用能力，但對其余5類碳源的利用能力均降低（表3）。

表3不同連作年限高粱根際土壤微生物群落的分類碳源代謝活性

不同處理根際土壤微生物對31種碳源代謝的 值進行熱圖聚類分析（圖2），與CK相比，C5降低了對碳水化合物類（B3，D-Galacturonic Acid、E2，NAcetyl-D-Glucosamine、D2，D-Mannitol、F2，D-Glucosaminic Acid）、氨基酸類（B4，L-Asparagine）、多聚物類（C1，Tween 40）的代謝能力，但C5增加了對羧酸類（H3，D-Malic Acid）的代謝能力；C10增加了對碳水化合物類（B2，D-Xylose、H1，a-D-Lactose、G1，D-Cellobiose、A2，β-Methyl-D-Glucoside）、羧酸類（H3，D-Malic Acid）的代謝能力。

2.4 不同連作年限高粱根際土壤微生物群落碳源利用能力的主成分分析

圖3中連接原點和碳源的向量長度可度量微生物碳源代謝能力差異的貢獻值，向量越長表示該碳源對微生物代謝差異的貢獻值越大。從圖3可以看出，C5和C10在PC1上分異較大，而CK在PC2上與C5、C10分異較大；碳水化合物類（CB）對各處理分異貢獻最大，其次為多聚物類（PO）、氨基酸類（AA）、羧酸類（CA）。

3 結論與討論

在農業生產中，多種作物都會出現連作障礙現象[15，19-20]。LIU等[19]報道，隨著大豆連作年限的延長，大豆產量逐年下降。XIONG等[20]研究表明，長期連作顯著影響黑胡椒長勢。已有研究表明，高粱不耐連作，連作3 a后高粱生長和產量明顯下降[13]，且隨著連作年限的增加，高粱單株產量、單株干物質量持續降低[21]。本研究也證實了這一結論，與輪作對照相比，連作高粱長勢減弱，連作10 a高粱株高、莖粗和生物量均顯著低于連作5 a。

根際是植物-土壤-微生物相互作用的中心，根際土壤微生物可敏感反映土壤環境的變化[22]。BIOLOG-ECO微平板法可以從微生物碳源代謝角度，反映土壤微生物代謝活性及代謝功能多樣性[10]。本研究顯示，相比輪作，高粱連作5 a時根際土壤的AWCD值、功能多樣性指數降低，而連作10 a時AWCD值、功能多樣性指數升高，但不同連作年限都顯示出對羧酸類代謝能力增加。岳冰冰等[23]對連作7 a煙田土壤微生物功能多樣性的研究表明，連作明顯降低了煙田土壤微生物碳源利用能力，烤煙連作后土壤微生物代謝活性及功能多樣性降低。已有研究表明，烤煙連作后土壤中真菌比例顯著增加，破壞了土壤微生物群落結構的平衡[24]，隨烤煙連作年限的增加細菌多樣性指數呈下降趨勢，真菌多樣性指數有上升趨勢[25]。對馬鈴薯、黃瓜連作土壤細菌群落結構的研究也有相似結論，隨著連作年限的增加，細菌群落結構多樣性和豐富度持續下降。孟品品等[26]研究發現，連作馬鈴薯會增加土壤中真菌類病原菌鐮刀菌。然而基于不同作物，不同連作年限土壤微生物群落多樣性的變化也有不同報道。朱琳等[27]對大豆不同連作年限的研究表明，連作10 a以上大豆土壤微生物群落的豐富度和多樣性增加。劉株秀等[28]的研究也有一致規律，與大豆、玉米輪作體系相比，連作13 a大豆土壤微生物群落豐富度和多樣性顯著高于連作3 a和連作5 a。寇智瑞等[29]對不同連作年限黃壤煙田土壤細菌群落的研究發現，煙田連作5 a內土壤微生物群落多樣性和豐富度逐漸上升，連作5 a時微生物群落豐富度最高，煙田連作8 a后土壤微生物群落豐富度與植煙1 a相比顯著降低，隨連作年限的增加，微生物豐富度下降更加明顯。本研究表明，隨連作年限的增加，高粱根際土壤中微生物的代謝活性及代謝功能多樣性呈現先降低后升高的趨勢，且不同連作年限都表現出對D-蘋果酸的代謝活性增加，造成這一現象的原因可能與高粱根際土壤微生物群落結構變化及高粱獨特的根系分泌物有關。隨著高粱連作年限的增加，土壤中真菌類有害菌群富集[14]，打破了土壤微生態平衡，進而降低土壤微生物群落的代謝活性，但隨著連作年限的增加，根系分泌物烴類和酯類化合物逐漸增加[21]，可能促進代謝此類物質的微生物繁殖，并在高粱根際逐年富集。本研究中，連作高粱根際對羧酸類代謝增加，也間接佐證了這一觀點。

綜上所述，連作導致高粱長勢減弱，根際土壤微生物代謝活性及功能多樣性發生變化，隨著連作年限的增加，作物長勢受到的抑制作用增加，但高粱根際土壤微生物代謝多樣性呈現先下降后上升的趨勢。本研究采用BIOLOG-ECO技術從代謝角度研究不同連作年限條件下高粱根際土壤微生物群落結構的變化，下一步仍需借助分子生物學方法明確連作年限的變化、根際土壤微生物的基因多樣性的變化以及根系分泌物富集哪些關鍵微生物菌群，探究高粱連作障礙機制。