一種水楊醛雙席夫堿熒光探針的合成及對(duì)Cr3+的識(shí)別

姚媛君,王嬌,劉婭娜,韓輝,王麗*

(1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)研究所,山西 太原 030006)

0 引言

人體內(nèi)的鉻元素主要以三價(jià)鉻形式存在[1-3]。三價(jià)鉻是葡萄糖耐量因子GTF(glucose tolerance factor)的組成成分,對(duì)葡萄糖的代謝至關(guān)重要[4]。在糖和脂代謝系統(tǒng)受到壓力的動(dòng)物中,Cr的藥理學(xué)相關(guān)劑量可以提高胰島素敏感性和血膽固醇水平,尤其是在Ⅱ型糖尿病的嚙齒動(dòng)物模型中[5]。Cr被認(rèn)為是胰島素作用中的人工第二信使[6]。血液中胰島素水平的增加以及胰島素信號(hào)通路的后續(xù)激活導(dǎo)致Cr從血流向組織移動(dòng),而Cr又通過(guò)與細(xì)胞中的胰島素信號(hào)機(jī)制相互作用而增強(qiáng)胰島素敏感性[5]。到目前為止,Cr3+的檢測(cè)廣泛采用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[7-8]、比色法、熒光光譜法[9-10]和電化學(xué)方法等。熒光光譜法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),從而受到科研工作者的關(guān)注,并顯示出巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。考慮到Cr3+對(duì)人體健康的潛在影響,所以設(shè)計(jì)合成一種高選擇性的Cr3+熒光探針尤為重要。

目前,席夫堿探針由于合成簡(jiǎn)單和選擇性好等特點(diǎn),已經(jīng)應(yīng)用于識(shí)別金屬離子,如Mg2+ [11],Hg2+ [12],Al3+ [13],Cu2+ [9]等。本文以2-肼吡啶和水楊醛為原料,合成了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚熒光探針L(合成如圖 1所示)。Jana等[14]合成了和本文類似的探針,在DMSO/HEPES buffer(V∶V=1∶9)體系中可以檢測(cè)Zn2+。而本文合成的探針L在無(wú)水乙醇/水(V∶V=1∶1)體系中對(duì)Cr3+,Fe3+,Al3+有響應(yīng),通過(guò)加入掩蔽劑NH4F可以除去Fe3+,Al3+的干擾[15-16],從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cr3+的選擇性識(shí)別,并可用于人體代謝物尿液中Cr3+的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PTI QuantaMasterTM400穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(美國(guó)PTI公司);Agilent Cary 8454紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫科技有限公司);Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士布魯克科技有限公司);Thermo Scientific Q Exactive高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);DHX低溫恒溫循環(huán)器(江蘇天翎儀器有限公司);2XZ-4型旋片式真空泵(上海玉龍公司);Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫公司);KQ-100E型超聲清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);ZF-6型臺(tái)式三用紫外分析儀(上海嘉鵬分析儀器有限公司)。

2-肼吡啶(質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為97%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);4-甲基苯酚(質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為99%,阿達(dá)瑪斯試劑有限公司),三氟乙酸(TFA,質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為99%,阿達(dá)瑪斯試劑有限公司);氘代二甲基亞砜(原子百分比99.8%,北京伊諾凱科技有限公司);無(wú)水硫酸鎂(分析純,太原新元素儀器儀表經(jīng)銷部),濃鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%,太原新元素儀器儀表經(jīng)銷部);試劑無(wú)水乙醇,甲醇,二氯甲烷,石油醚,乙酸乙酯,均為分析純,購(gòu)買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司;高效GF254薄層層析硅膠板(化學(xué)純,青島海洋化工有限公司);200-300目柱層層析硅膠(試劑純,青島裕民源硅膠試劑廠);試驗(yàn)用水為ELGA超純水機(jī)PURELAB Ultra制備的二次水。

1.2 探針L的合成

對(duì)甲基苯酚(1.06 mL, 10.0 mmol),六亞甲基四胺(2.80 g,20.0 mmol)溶于10.0 mL三氟乙酸(TFA)中,然后在氮?dú)庀录訜峄亓?2 h。反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫,加入鹽酸溶液(210 mL,4.00 mol·L-1),冰浴條件下攪拌24 h,用二氯甲烷萃取,加入無(wú)水硫酸鎂干燥,減壓蒸餾除去溶劑,殘余物用硅膠柱快速分離純化(乙酸乙酯/石油醚,V∶V=1∶19),得到白色固體,即為2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚a(0.328 g, 20.0%)。1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm):11.45 (s, 1H), 10.22 (s, 2H), 7.77 (s, 2H), 2.39 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):192.27, 160.34, 137.34, 129.28, 123.28, 19.54.

2-肼吡啶(65.5 mg, 0.600 mmol),2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚a(98.4 mg, 0.600 mmol)溶于5.00 mL甲醇中,回流3 h。冷卻至室溫,過(guò)濾掉固體,用甲醇重結(jié)晶得到淡黃色固體,即為4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚探針L(60.0 mg,28.9%)。表征結(jié)果如下:1H NMR (600 MHz,

圖1 L的合成路線Fig.1 Synthesis of probe L

DMSO-d6), δ (ppm):11.68 (d,J=22.0 Hz, 1H), 11.02 (s, 2H), 8.31 (s, 2H), 8.14 (t,J=13.7 Hz, 2H), 7.67 (t,J=8.3 Hz, 2H), 7.41 (s, 2H), 7.07 (d,J=8.4 Hz, 2H), 6.86-6.73 (m, 2H), 2.30 (s, 3H).13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):156.21, 152.48, 148.01, 128.12, 127.75, 120.76, 115.18, 106.30, 20.13. HRMS(ESI):C19H18ON6for [L+H]+, calculated 347.1576, found 347.1617。

1.3 光譜性質(zhì)的測(cè)定方法

將探針L溶于二甲基亞砜(DMSO)中,配制成濃度為2.00×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋至合適的濃度,靜置數(shù)秒后進(jìn)行紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜的檢測(cè)。所有光譜實(shí)驗(yàn)使用10 mm石英比色皿,激發(fā)狹縫寬5 nm,發(fā)射狹縫寬5 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 L和L-Cr3+的光譜特性

首先考察了L在無(wú)水乙醇/水(V∶V=1∶1)體系中與Cr3+的絡(luò)合性能。L在321 nm、368 nm處有2個(gè)吸收峰,另外在395 nm處還有一個(gè)肩峰(圖2a)。隨著溶液中加入的Cr3+濃度逐漸增大,L的吸收峰發(fā)生紅移,321 nm處的吸收峰紅移至331 nm、368 nm處的吸收峰紅移至377 nm。此外，原來(lái)288 nm處的吸收變?yōu)槊黠@的吸收峰,同時(shí)在293 nm和344 nm處出現(xiàn)2個(gè)等吸收點(diǎn),說(shuō)明L和Cr3+形成了新的絡(luò)合物。在365 nm的紫外燈下,溶液的顏色從無(wú)色變?yōu)榧t色(圖2a插圖A)。紫外可見(jiàn)吸收光譜中321 nm、368 nm處的吸收峰發(fā)生紅移可能是由于Cr3+的吸電子作用,降低了L的反鍵軌道能量,導(dǎo)致π→π*躍遷紅移。288 nm處出現(xiàn)吸收峰可能是源于配位原子的躍遷發(fā)生紅移后,與源于未參與配位原子的躍遷分離而變得更加明顯。如圖 2a插圖B所示,對(duì)L的吸收光譜進(jìn)行高斯擬合,吸收光譜大致由4種躍遷組成,配位作用導(dǎo)致受配位作用影響的躍遷紅移,而未受配位作用影響的躍遷基本不移動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了L和Cr3+配位后熒光光譜的變化。以380 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，L在578 nm處幾乎沒(méi)有發(fā)射峰(圖 2b)。隨著Cr3+濃度的逐漸增加，578 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，原因可能是L與Cr3+的絡(luò)合后，探針?lè)肿觿傂曰痆17]。基于這一現(xiàn)象建立了L與Cr3+配位后的熒光增強(qiáng)分析方法。

熒光滴定實(shí)驗(yàn)表明(圖2b),在一定范圍內(nèi)隨著Cr3+濃度的增加,L最大發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。體系在578 nm處的熒光強(qiáng)度I578 nm與Cr3+的濃度在4.00×10-6～4.00×10-5mol·L-1范圍內(nèi)呈線良好的線性關(guān)系(圖2b插圖)。由此可以實(shí)現(xiàn)探針L對(duì)Cr3+的定量檢測(cè),檢測(cè)限為8.56×108mol·L-1(3 S/N)。通過(guò)與已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)Cr3+的光學(xué)探針相比,本文所報(bào)道的探針不僅具有更實(shí)用環(huán)保的檢測(cè)體系,而且合成方法簡(jiǎn)單,檢測(cè)限較低,為進(jìn)一步拓展其在離子傳感器方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)(表1)。

圖2 L紫外吸收光譜隨Cr3+濃度的變化(a) L熒光發(fā)射光譜隨Cr3+濃度的變化(b)Fig.2 (a) Absorption spectra of L (1.0×10-5 mol·L-1) in the presence of differentconcentrations of Cr3+(0～10.0 equiv).Inset (A) The deconvolution of L’s absorption spectra.Inset (B) Fluorescence color change of L in the presence of Cr3+.(b)Fluorescence spectra of L (4.0×10-6 mol·L-1)in the presence of different concentrations of Cr3+ (0～10.0 equiv).The inset shows the fluorescence intensity of L as a function of Cr3+ concentration

表1 探針L與現(xiàn)有的Cr3+探針的比較

2.2 L對(duì)Cr3+的選擇性檢測(cè)

L對(duì)Cr3+的選擇性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Fe3+、Al3+對(duì)Cr3+的測(cè)定具有干擾作用,通過(guò)加入掩蔽劑NH4F可以除去Fe3+、Al3+干擾。除在Cr3+、Fe3+、Al3+的溶液中各加入5.00×10-5mol·L-1的NH4F掩蔽劑外,其余實(shí)驗(yàn)條件均相同,測(cè)定了其他金屬離子對(duì)L熒光強(qiáng)度的影響,只有Cr3+能使L溶液的熒光增強(qiáng)(圖3a)。同時(shí)考察了L作為熒光傳感器檢測(cè)Cr3+的抗干擾性,發(fā)現(xiàn)共存離子Zn2+和Cu2+對(duì)Cr3+有干擾,此時(shí)先加入和Zn2+、Cu2+等量的探針L,待L和Zn2+,Cu2+充分反應(yīng)后,L可以繼續(xù)檢測(cè)Cr3+。其他干擾離子對(duì)L-Cr3+的熒光強(qiáng)度基本沒(méi)有影響(圖3b)。上述結(jié)果表明,L可以選擇性的識(shí)別檢測(cè)Cr3+,且在Cr3+檢測(cè)中有較好的抗干擾能力。

2.3 結(jié)合模式

通過(guò)等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定了L與Cr3+的絡(luò)合比,當(dāng)L與Cr3+的濃度比為1∶2時(shí),體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值(圖 4a),表明L與Cr3+的絡(luò)合比為1∶2。

圖3 加入掩蔽劑NH4F后,L對(duì)金屬陽(yáng)離子的選擇性(a) 陽(yáng)離子競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)(b)Fig.3 (a) Fluorescence spectra changes of L (4.00×10-6mol·L-1)in the presence of various metal ions (400×10-5mol·L-1) and “masking” reagent NH4F.(b) Fluorescence intensities of L (4.00×10-6mol·L-1)at 578 nm (I578 nm) upon addition of Cr3+ in the presence of interfered metal ions and “masking” reagent

圖4 等摩爾連續(xù)變化法測(cè)L-Cr3+結(jié)合比(a)和B-H方程測(cè)L-Cr3+結(jié)合常數(shù)(b)Fig.4 (a) Job’s plot for L and Cr3+ complexation， the total concentration of L and Cr3+ is 4.00×10-5mol·L-1；(b) Benesi-Hildebrand plot from fluorescence titration data of L with Cr3+

圖5 L與Cr3+結(jié)合模式圖及核磁滴定圖Fig.5 Top The proposed binding mode of L/Cr3+system. Bottom 1H NMR spectra of L in the presence of different concentrations of CrCl3·6H2O in DMSO-d6:(a) L; (b) L+Cr3+ (0.2 equiv.); (c) L+Cr3+ (0.6 equiv.)

此外,采用Benesi-Hildebrand方程[21]計(jì)算得出L與Cr3+的結(jié)合常數(shù)為2.57×109(mol/L)2(圖4b)。

為了進(jìn)一步探究L與Cr3+的結(jié)合模式,以DMSO-d6為溶劑,通過(guò)核磁滴定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。如圖5所示,加入CrCl3后,11.70處的羥基質(zhì)子H3消失,8.31處的質(zhì)子H4,H4′向低場(chǎng)區(qū)移動(dòng),質(zhì)子H6,H6′,H7,H7′,H8,H8′,H9,H9′峰信號(hào)變寬,并輕微向低場(chǎng)區(qū)移動(dòng)。由核磁滴定實(shí)驗(yàn)可知,L與Cr3+可能是通過(guò)亞胺N,吡啶N和酚羥基結(jié)合的,質(zhì)子H5,H5′消失的原因可能是,用D2O配制的CrCl3·6H2O的滴加,使得質(zhì)子H5,H5′被D2O置換。

2.4 實(shí)際尿樣分析

為了評(píng)估探針L檢測(cè)Cr3+方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性和可行性,本文采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)人體代謝物尿液中的Cr3+進(jìn)行檢測(cè)。收集兩個(gè)健康成年人的尿液,過(guò)濾,稀釋100倍,加入5.00×10-5mol·L-1的NH4F掩蔽劑,將3種已知濃度的Cr3+(0.00 mol·L-1,1.00×10-5mol·L-1,2.00×10-5mol·L-1)加入預(yù)處理后的尿液中,然后用標(biāo)準(zhǔn)線性方程分析尿液中的Cr3+濃度,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。如表2所示,該探針能夠檢測(cè)加標(biāo)Cr3+的濃度,回收率在96.5%～105.5%范圍內(nèi),RSD值在2.05%～4.65%之間,表明本文建立的方法可以有效應(yīng)用于人體代謝物尿液。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種在無(wú)水乙醇/水(V∶V=1∶1)體系中識(shí)別檢測(cè)Cr3+的4-甲基-2,6-二(吡啶-2-酰基肼甲基)苯酚熒光探針L。L在無(wú)水乙醇/水(V∶V=1∶1)體系中對(duì)Cr3+、Fe3+、Al3+均有響應(yīng),通過(guò)加入掩蔽劑NH4F可以除去Fe3+、Al3+的干擾,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cr3+的選擇性識(shí)別,其檢出限為8.56×108mol·L-1。定量分析結(jié)果顯示L與Cr3+的結(jié)合計(jì)量比為1∶2,結(jié)合常數(shù)為2.57×109(mol·L-1)。尿樣檢測(cè)的回收率為96.5%～105.5%,表明L對(duì)人體代謝物尿液中Cr3+的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表2 實(shí)際尿樣中Cr3+含量的回收率測(cè)定