SOD1、SOD2基因缺失對砷誘導酵母細胞凋亡的影響

吳麗華,儀慧蘭,陳燕飛,喬宏萍,趙文婧

(1.太原師范學院 生物系,山西 晉中 030619;2.山西大學 生命科學學院,山西 太原 030006)

0 引言

細胞凋亡是一種由基因嚴格控制的程序性細胞死亡方式,在調控機體生長發育和對外界刺激的反應等生物學過程中起重要作用。已有研究表明,細胞凋亡的異常可增加多種疾病的發病率,如神經退行性疾病、中風,甚至癌癥等[1]。因此,細胞凋亡成為近年來整個生命科學領域關注的研究熱點。

砷是一種廣泛分布于自然界中的有毒元素,可以通過皮膚、消化道、呼吸道等多種途徑進入人體,并可對人體健康造成嚴重威脅[2]。大量研究顯示,長期或急性接觸砷可破壞機體原有的氧化/還原平衡,誘導生物體內活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的產生[3-5]。當體內大量ROS無法被及時清除時,即可引起細胞死亡或凋亡[6-8]。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是生物體內重要的抗氧化酶之一。在模式生物酵母細胞中,SOD主要包括分布于細胞質和線粒體膜間隙的CnZnSOD(SOD1)和分布于線粒體基質內的MnSOD(SOD2)[9]。我們的前期研究表明,高濃度砷可改變酵母細胞SOD及其他抗氧化酶活性,引起細胞氧化損傷,誘導細胞死亡或凋亡[10-11],但SOD1和SOD2基因在砷誘導酵母細胞凋亡中的作用機制尚不清楚。因此,本實驗選用酵母野生株BY4741和其突變體Δsod1,Δsod2為研究材料,研究SOD1和SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導酵母細胞凋亡的影響,以期為砷的毒性機理提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 菌株

釀酒酵母BY4741(MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0,WT)及其突變體Δsod1和Δsod2,均購自Invitrogen公司。

1.2 材料培養

挑取酵母細胞單菌落接種于YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)液體培養基中(1%酵母粉,2%蛋白胨,2%葡萄糖，純度為質量百分數),28℃,180 r/min恒溫震蕩培養至對數期后用于毒性處理。固體培養基中需加入質量百分數為1.5%～2%的瓊脂粉。

1.3 細胞生長測定

取適量對數期細胞接種于含有不同濃度亞砷酸鈉(0～2 mmol/L)的液體培養基中(每個樣本初始OD600一致),28℃,180 r/min恒溫震蕩培養,每隔2 h取適量培養液測其OD600,繪制生長曲線;以野生株酵母(WT)培養24 h后的OD600為對照,計算相對生長率(OD600處理組/OD600野生株對照組×100%)。收集所有菌株培養24 h后，對照組和1 mmol/L處理組細胞,檢測胞內ROS水平、線粒體膜電位和細胞凋亡率。

1.4 細胞存活率測定

參照Zheng等方法[12],將適量對數期細胞涂布至含有不同濃度亞砷酸鈉的平板上,每個平板含有細胞數約200個,28 ℃恒溫倒置培養48 h后觀察計數單菌落數,并計算細胞相對存活率(處理組單菌落數/對照組單菌落數×100%)。每個處理組至少3個重復。

1.5 細胞凋亡率、胞內ROS和線粒體膜電位測定

將用PBS洗滌后的酵母細胞用適量Annexin Ⅴ-FITC結合液重懸后加入Annexin Ⅴ-FITC和Propidium Iodide(碘化丙啶,PI)染液;或分別懸浮于一定濃度的2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA,ROS熒光探針)和Rhodamine 123(Rho123,羅丹明123)中,混勻,避光孵育20 min,用流式細胞儀檢測酵母細胞凋亡率、胞內ROS水平和線粒體膜電位。其中,每個樣品由3個平行樣品混合,檢測不少于50 000個細胞。

1.6 統計分析

采用SPSS 18.0對所得結果進行差異顯著性分析,野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性用“*”表示(*P<0.05,**P<0.01);相同砷濃度處理組中,突變株與野生株間的差異顯著性用“&”表示(&P<0.05,&&P<0.01)。

2 結果

2.1 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉抑制酵母細胞生長的影響

從圖1A可以看出,野生株酵母在亞砷酸鈉脅迫下,生長受到抑制。隨著亞砷酸鈉濃度的升高,培養液OD600逐漸降低；當亞砷酸鈉濃度為2 mmol/L時,酵母細胞幾乎完全停止生長,抑制率高達92.86%。在1 mmol/L和1.5 mmol/L處理組中,培養24 h后,Δsod1相對生長率顯著低于野生酵母,而Δsod2相對生長率與野生酵母無顯著差異(圖1B)。結果說明,亞砷酸鈉可抑制酵母細胞生長,SOD1基因在細胞生長過程中起重要作用。

2.2 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導酵母細胞死亡的影響

由圖2可知,野生酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫后,細胞相對存活率隨砷濃度的升高而逐漸降低。在1～2 mmol/L處理組中,細胞相對存活率顯著低于對照組。1 mmol/L和1.5 mmol/L處理組中,Δsod1相對存活率顯著低于野生酵母,分別為野生株的21.52%和2.09%;Δsod2與野生酵母間無顯著差異(P>0.05)。根據細胞相對生長率和存活率結果,我們在后續實驗中選取1 mmol/L作為亞砷酸鈉處理濃度。

A, 野生株; B, 野生株與突變體注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖1 亞砷酸鈉對酵母細胞生長的影響A, WT strain; B, WT and mutant strainsNote: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01) between the control and arsenite treatment groups in WT strain; “&” indicates the significant difference (&P<0.05,&&P<0.01)in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.1 Effect of NaAsO2 on yeast cell growth

2.3 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導酵母細胞凋亡的影響

為了進一步驗證SOD1和SOD2基因在亞砷酸鈉脅迫過程的作用,采用Annexin V/PI雙染法研究了釀酒酵母SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉誘導酵母細胞凋亡的影響。從圖3可以看出,對照組中野生株與突變株間早期凋亡率無顯著差異(P>0.05);經1 mmol/L亞砷酸鈉脅迫24 h后,所有菌株細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05),而突變株Δsod1和Δsod2細胞早期凋亡率分別為野生株的1.82倍和1.28倍,均顯著高于野生株細胞(P<0.05)。結果說明,亞砷酸鈉可誘導酵母細胞發生凋亡,而SOD1和SOD2基因在亞砷酸鈉誘導的細胞凋亡中起重要作用。

2.4 SOD1、SOD2基因缺失對亞砷酸鈉引起酵母細胞ROS水平和線粒體膜電位變化的影響

用1 mmol/L亞砷酸鈉脅迫酵母細胞24 h后,采用DCFH-DA和Rh123特異性熒光探針檢測胞內ROS水平和線粒體膜電位(圖4)。經熒光顯微鏡觀察發現,細胞熒光強度均明顯高于對照組(P<0.05)。胞內ROS水平檢測結果顯示,在亞砷酸鈉處理組中,所測菌株胞內ROS水平均顯著高于對照組(P<0.05),突變株Δsod1胞內ROS水平為野生株的2.98倍,兩者間具有顯著差異(P<0.05)。線粒體膜電位檢測結果顯示,酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫后,所測菌株中線粒體膜電位均顯著下降,其中突變株Δsod1顯著低于野生株(P<0.05);ROS水平和線粒體膜電位在Δsod2突變株與野生株間均無顯著差異(P>0.05)。結果說明,亞砷酸鈉可誘導酵母胞內ROS產生,引起線粒體膜電位下降,而SOD1基因可有效降低亞砷酸鈉引起的胞內ROS水平,并在維持細胞線粒體膜電位中起重要作用。

注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖2 亞砷酸鈉對酵母細胞存活率的影響Note: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01) between the control andarsenite treatment groups in WT strain;“&” indicates the significant difference(&P<0.05,&&P<0.01) in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.2 Effect of NaAsO2 on theclonogenic survival rate in yeast cells

A, Annexin/PI 雙染凋亡流式圖; B, 根據A圖所做注:“*”表示野生酵母中處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05, **P<0.01);“&”表示相同濃度砷處理組間突變株與野生株間的差異顯著性(&P<0.05,&&P<0.01)圖3 亞砷酸鈉對酵母細胞凋亡的影響A, Cell apoptosis was measured by Annexin and PI double-staining; B, According to figure ANote: “*” indicates the significant difference(*P<0.05, **P<0.01)between the control and arsenite treatment groups in WT strain; “&” indicates the significant difference (&P<0.05,&&P<0.01)in the mutants compared to the WT strain at the same arsenite treatment groupsFig.3 Effect of NaAsO2 on cell apoptosis in yeast cells measured by flow cytometry assay

A, 胞內ROS水平; B, 線粒體膜電位圖4 亞砷酸鈉對酵母細胞內ROS水平和線粒體膜電位的影響A, Intracellular ROS levels; B, Mitochondrial membrane potentialFig.4 NaAsO2 induced production of intracellular ROS and disruption of mitochondrial membrane potential (Δψ) in yeast cells

3 討論

已有研究證明,砷化物可抑制小鼠空腸組織的抗氧化物酶活性,引起小鼠空腸氧化損傷和組織結構改變[13];引起植物保衛細胞死亡,并伴隨著胞內ROS水平的升高[8],說明氧化應激機制是砷毒性機制之一。

ROS是一類機體在有氧代謝過程中產生的活性含氧化合物,在生物正常代謝過程中起重要作用。當機體受到外界刺激時,可引起細胞內抗氧化物酶活性增強,以清除體內由于外界脅迫產生的過量的ROS,從而維持胞內的氧化還原平衡;當胞內ROS產生過多而來不及清除時,機體則會發生氧化應激反應,胞內ROS水平升高[14]。胞內較高濃度的ROS可導致DNA、蛋白質和脂類等生物大分子功能的破壞,或通過攻擊蛋白質,使細胞內線粒體膜結構受損,使線粒體膜電位改變,最終引起細胞凋亡或死亡[15-18]。本實驗中亞砷酸鈉可抑制酵母細胞生長,細胞死亡率和凋亡率升高,同時伴隨著胞內ROS水平的升高和線粒體膜電位的下降。在相同濃度砷處理組中,Δsod1突變株細胞存活率和線粒體膜電位均顯著低于野生株,胞內ROS水平和細胞凋亡率均顯著高于野生株;Δsod2突變株凋亡率顯著高于野生株,而其他檢測指標與野生株間均無顯著差異。結果說明,亞砷酸鈉可誘導酵母細胞發生依賴于線粒體途徑的細胞凋亡,且亞砷酸鈉誘導的酵母細胞死亡與胞內ROS水平相關。

SOD是體內關鍵的抗氧化物酶,在酵母細胞中,編碼銅鋅超氧化物歧化酶的SOD1基因和錳超氧化物歧化酶的SOD2基因均可特異性清除胞內超氧陰離子,從而降低胞內ROS水平,以避免ROS對機體的損傷作用[19]。張小華等[20]研究發現,SOD基因與高溫、乙醇和高滲透壓等多種脅迫耐受性均密切相關。我們以Δsod1和Δsod2突變株,以及野生株BY4741為材料,研究亞砷酸鈉對酵母細胞的毒性作用。結果顯示,酵母細胞經高濃度亞砷酸鈉脅迫24 h后,本研究所用菌株細凋亡率均顯著升高;在相同濃度砷處理組中,Δsod1和Δsod2細胞凋亡率顯著高于野生株,說明SOD基因在亞砷酸鈉脅迫誘導的酵母細胞凋亡中起重要作用。

綜上所述,亞砷酸鈉可誘導酵母細胞內ROS水平升高,線粒體膜電位下降,細胞發生凋亡;SOD1和SOD2敲除后,細胞凋亡率顯著升高。結果說明,亞砷酸鈉誘導胞內ROS水平升高是酵母細胞死亡的一個誘因,SOD基因與亞砷酸鈉誘導的酵母細胞凋亡密切相關。