基于低共熔溶劑的微波輔助法提取連翹酯苷A

周立錦,董哲,張立偉,杜會枝

(山西大學 分子科學研究所,山西 太原 030006)

0 引言

近年來,綠色溶劑在解決傳統溶劑帶來的環境問題、降低提取成本、提高產品安全性等方面具有廣泛應用[1]。自2003年Abbott等[2]提出低共熔溶劑(Deep eutectic solvents,DESs)概念以來,其作為傳統溶劑的替代品迅速受到廣泛關注。DESs是由兩種或三種不同組分以氫鍵作用結合得到的混合溶劑[3],包括氫鍵供體(Hydrogen bond donors,HBDs)和氫鍵受體(Hydrogen bond acceptors,HBAs),其中氫鍵受體多為氯化膽堿(Choline chloride, ChCl),氫鍵供體多為胺、酸、糖和醇等。由于合成簡便、成本低、毒性低和物理化學性質的可設計性等優勢,DESs已被廣泛應用于有機催化[4]、電化學[5]、納米材料[6]和生物轉化[7]等領域。

近期,DESs已經被大量用于從植物中提取生物活性化合物[8]。DESs不僅可以通過氫鍵相互結合,還能夠提供電子或接受外部電子及質子形成分子間氫鍵,后者可以使它們更容易溶解各類物質。最近有文獻報道使用DESs對日本扁柏葉中黃酮類化合物[9]、槐米中蘆丁[10]和人參中人參皂苷[11]進行提取,目標化合物均得到較高的提取效率和溶解度。Duan等通過評估5種中藥材在43種DESs的提取效率,證明DESs是一種有效提取中藥活性成分的綠色溶劑[12]。

連翹是山西省道地藥材之一,具有抗菌、抗炎和抗氧化作用[13],主要成分包括連翹酯苷和連翹苷等[14-15],而連翹酯苷A是其中主要的有效成分之一。采用傳統溶劑如水、甲醇、乙醇等從連翹中提取活性成分已有較多報道[16-19],本課題組評價了青翹60%乙醇(體積分數)提取物的抗氧化等活性[20];用不同比例甲醇水溶液等度洗脫連翹花水提物,研究了所得組分的抑制乙酰膽堿酯酶活性[21];還用體積分數為70%甲醇超聲提取青翹、老翹及連翹不同部位的總苯乙醇苷含量[22]。這些方法缺點較為明顯,如耗時長,成本高和溶劑污染環境等。因此需要找到一種更簡單、快速和經濟的方法來提取連翹。許多研究報道將DESs應用于從多種植物中提取生物活性化合物,然而,DESs對連翹的提取效率仍未可知。因此,本研究篩選了對連翹酯苷A提取效率高的DESs,優化了提取條件,并對提取液的抗炎和抗氧化等生物活性進行評估。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

微波輔助加熱提取儀:XH-100A,北京祥鵠科技發展有限公司;超聲波清洗器:SK2200HP,上海科導超聲儀器有限公司;高效液相色譜儀:Agilent 1260,德國;酶標儀:MD Spectra Max 190,美國Molecular devices公司;掃描電子顯微鏡:JEOL-JSM-6701F,日本電子公司。

1.2 制備DESs

將一定摩爾比混合的ChCl和HBD(乙二醇,1,2-丙二醇,丙三醇和1,4-丁二醇)置于圓底燒瓶中,90℃水浴加熱下攪拌6～12 h,直至形成均勻、透明無色的液體,制備得到10個DESs，見表1。

表1 DESs(氫鍵受體為ChCl)

1.3 制備連翹提取液

將連翹在打粉機中研磨,過80目篩得到粉末,避光密封保存。將一定比例的連翹粉末和DESs混勻,在微波輔助加熱提取儀中提取,濾去藥渣得到連翹DESs提取液。70%甲醇提取參照藥典方法[13]:70%甲醇為溶劑,液固比30 mL·g-1,超聲30 min (功率250 W,頻率40 kHz),用70%甲醇補重,搖勻,過濾。表2涉及的其他提取方法中,液固比25 mL·g-1,溶劑包括:100%甲醇,70%甲醇,100%乙醇和水。提取方法包括:加熱回流,超聲和微波輔助方法。加熱回流方法:回流提取兩次,每次2 h,用相應溶劑補重,搖勻,用紗布過濾,合并兩次濾液。超聲方法:提取功率250 W,提取頻率40 kHz,提取時間30 min,用相應溶劑補重,搖勻,紗布過濾。微波方法:提取溫度95℃,提取功率1 000 W,液固比25 mL·g-1,提取時間329.97 s,用相應溶劑補重,搖勻,紗布過濾。

連翹提取液經0.45 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析,連翹提取液經無菌0.22 μm微孔濾膜過濾后用于細胞實驗。

1.4 HPLC分析

用Agilent 1260 高效液相色譜儀進行HPLC分析。分析條件為:Agela Technologies Venusil XBP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫25℃,進樣量10 μL,流速0.8 mL·min-1,檢測波長280 nm,以色譜甲醇為流動相A,以0.3%醋酸水溶液為流動相B;梯度洗脫條件為:0～8 min,30%～33%(A),70%～67%(B);8～24 min,33%～40%(A),67%～60%(B);24～39 min,40%～48%(A),60%～52%(B);39～55 min,48%～64%(A),52%～36%(B)。

1.5 細胞培養與分組，MTT法檢測細胞活性和NO含量的檢測

PC12細胞培養在含有10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI 1640培養基中,HepG2細胞和RAW 264.7細胞培養在加入10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養基中。取對數生長期細胞,配制懸液,96孔板每孔中接種100 μL(2×104個細胞)。

檢測提取液抗炎實驗中將RAW 264.7細胞分為對照組、模型組、提取液組、陽性藥組及DESs溶劑組。對照組為正常培養的細胞;模型組用LPS(2 μg·mL-1)孵育24 h細胞;連翹DESs提取液組和連翹水提液組用120、1 200和3 000 mg·L-1的DESs提取液和相同濃度的水提液預處理細胞2 h后,再用LPS(2 μg·mL-1)孵育24 h細胞;在含3 000 mg·L-1DESs溶劑的培養基中培養的細胞為DESs溶劑組;陽性藥組用Dex(1 μmol·L-1)預處理細胞2 h后,再用LPS(2 μg·mL-1)處理24 h細胞。

MTT法檢測細胞毒性實驗中,對照組為正常培養的細胞;DESs溶劑組使用含有不同濃度的DESs溶劑(1 200、12 000、18 000、24 000 mg·L-1)處理24 h的細胞。細胞培養液中加入MTT(終濃度為5 mg·mL-1)。4 h后,每孔中加入111 μL增溶劑(異丙醇∶1 mol·L-1HCl=24∶1, (V∶V))。560 nm處檢測吸光度值。

（3）芬頓的備用處理，極好地協調了經濟和運行有效性，芬頓不使用時，可充作酸化系統，將酸化與甲烷化過程分開，提高COD降解效率。

用NO試劑盒檢測各組的NO含量,收集各組的細胞培養液上清,根據NO試劑盒說明書進行操作,最后在540 nm測定吸光度值,根據說明書的公式計算出相應NO的含量。

1.6 DPPH·抗氧化實驗

用無水乙醇配制39.44 μg·mL-1DPPH儲備溶液。將100 μL不同濃度的提取物(630、1 260、1 890、2 520、3 150、3 780和4 095 mg·L-1)和等體積的DPPH儲備溶液混勻加入96孔板中,25℃避光孵育30 min。520 nm處檢測吸光度值。

1.7 統計學分析

數據采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。使用ANOVA分析和t檢驗判定兩組間的差異性,P<0.05具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 篩選DESs

氫鍵供體的結構對DESs的物理化學性質有顯著影響[23]。本文使用4種多元醇與ChCl成功制備了10個DESs,其縮寫和標號列于表1。0.5 g連翹粉末和15 mL DESs(30%水,V∶V)在80℃、800 W微波輔助提取10 min,得DESs提取液。不同DESs對連翹酯苷A的提取率如圖1A所示,DES-4與參考藥典方法提取效果(116.68 mg·g-1)最接近,因此,選取DES-4作為后續實驗中的提取溶劑。

2.2 篩選DESs中的含水量

DESs含水量決定了其黏度,是影響目標化合物提取率的關鍵因素之一,溶質的溶解度和提取率隨著DESs黏度的降低而增加[9]。考察DES-4中含水量對連翹酯苷A提取率的影響。如圖1B所示,DES-4中不含水時連翹酯苷A提取率最低,僅有98.99 mg·g-1;含水量增加至20%時,提取率達到118.28 mg·g-1,含水量繼續增加時,提取率反而下降。基于此,選擇20%含水量(V∶V)的DES-4作為溶劑來進行后續實驗。

2.3 優化微波輔助提取條件

由于提取時間,提取溫度,提取功率和液固比是影響化合物提取率的重要因素,本研究中優化了這4個提取因素。使用Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken design(BBD,Stat-Ease,美國)優化DES-4提取條件,如表2所示,通過單因素考察得出:提取時間270～330 s,提取溫度85～95℃,提取功率800～1 000 W,液固比25～35 mL·g-1。

A:不同DESs中連翹酯苷A提取率(30%水),M代表70%甲醇;B:DES-4中不同含水量對連翹酯苷A提取率的影響。數據表示為平均值±SD n=3圖1 篩選DESs和含水量A:The extraction yields for forsythoside A using different DESs (30% water),M:70% Methanol;B:Effects of the different water contents in DES-4 on the extraction yields for forsythoside A.Data are represented as mean±SD n=3Fig.1 Screening of DESs and water content in DESs

表2 Box-Behnken design設計方案

經ANOVA分析(表3),對連翹酯苷A提取率建立的模型P<0.0001,失擬項(Lack of Fit)P>0.05,且R2值為0.989 6,表明模型與實驗結果鍥合,模型失擬項不顯著,擬合程度好,模型建立較好。擬合得到二次回歸方程:

Y=296.905+0.968X1-5.969X2-0.362X3+3.274X4-1.484×10-3X1X2+1.795×10-4X1X3+1.859×10-3X1X4+1.090×10-4X2X3-1.553×10-2X2X4-2.195×10-3X3X4-1.741×10-3X12+3.973×10-2X22+2.597×10-4X32-7.017×10-3X42

其中,Y為連翹酯苷A提取率,X1、X2、X3、X4分別代表提取時間、提取溫度、提取功率和液固比。

表4為預測不同提取條件下連翹酯苷A提取率。由表中可見:在提取時間329.97 s,提取溫度95℃,提取功率1 000 W,液固比25 mL·g-1的提取條件下,連翹酯苷A提取率最大,為139.426 mg·g-1,將這些參數確定為最優提取條件。根據實際操作原因,將提取時間確定為330 s。圖2為4種因素兩兩相互作用對連翹酯苷A含量的響應面圖,從圖中可以看出,對連翹酯苷A提取率影響較大的因素為提取功率和提取溫度:提取功率越大,提取溫度越高,提取率越大。隨著提取時間的增加,連翹酯苷A提取率先升后降;而隨著液固比的逐漸增大,連翹酯苷A提取率逐漸降低。

表3 對BBD實驗結果進行ANOVA結果

表4 預測不同提取條件下連翹酯苷A提取率

圖2 連翹酯苷A提取率的3D響應面圖Fig.2 3D response surface plots of the extraction yields of forsythoside A

2.4 方法學考察

進一步對優化的提取方法進行方法學考察。表5列出了標準曲線方程等信息,顯示了日內、日間精密度相對標準偏差(RSD)均小于3%,表明此方法精密度良好;平行提取六次顯示該方法重復性和穩定性良好。

表6為連翹酯苷A的加樣回收率。在低、中、高3個濃度下樣品的加樣回收率均在96%以上,表明該方法適用于提取連翹中的連翹酯苷A。方法學考察證明本文建立的提取方法是有效、穩定的。

2.5 與傳統提取方法比較連翹酯苷A提取率

為了評估在優化的提取條件下連翹酯苷A的提取率,本文選取常用的幾種溶劑(水、70%甲醇、100%甲醇、100%乙醇)分別加熱回流等方法提取連翹酯苷A,結果如表7所示,本文中優化的提取方法對連翹酯苷A提取率高于其他方法,證明了優化后的提取方法更適用于連翹酯苷A提取。

表5 HPLC測定連翹酯苷A標準曲線方程,線性范圍,精密度,重復性和穩定性

表6 連翹酯苷A的加樣回收率(n=3)

表7 不同提取方法中連翹酯苷A提取率 (mg·g-1)

為了探索植物細胞破裂程度與植物細胞中化合物釋放率之間的相關性,通過掃描電子顯微鏡觀察連翹提取前后的微觀結構(圖3,×3 000)。從圖3中可以看出,提取前連翹細胞表面完整,無任何破壞痕跡;4種常見溶劑加熱回流提取對連翹細胞均有一定程度損傷;DESs微波輔助提取后,連翹細胞徹底破裂并塌陷,破損程度最大。總之,連翹微觀結構的破損程度與連翹酯苷A提取率呈正相關性,基于DESs微波輔助提取破壞了植物細胞壁,使更多的化合物溢出,得到了更高的提取率。

2.6 連翹DES-4提取液的抗炎和抗氧化生物活性評估

本文用PC12細胞,HepG2細胞和RAW264.7細胞對DES-4提取溶劑的細胞毒性進行評估。如圖4所示,與對照組相比,溶劑組的細胞存活率沒有明顯變化。

LPS誘導的RAW264.7細胞是常用的體外炎癥模型。圖5A顯示了提取液組具有減輕細胞損傷和增加細胞活力的作用,呈劑量依賴性;DESs提取液組比相應濃度的水提取液組有更好的改善作用;高濃度DESs提取液組(3000mg·L-1)與陽性藥組(1 μmol·L-1Dex)作用相當。圖5B表明與LPS組相比,提取液組呈劑量依賴性降低了炎癥因子NO的含量;與水提液組相比,DESs提取液組展現了較好的抗炎效果;但是本文中高濃度DESs提取液組(3 000 mg·L-1)也不及陽性藥組(1 μmol·L-1Dex)作用。DES-4提取溶劑本身并沒有減輕細胞損傷和抗炎作用。DPPH·是一種監測含有自由基化學反應的物質,廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力,通過DPPH·自由基清除實驗對DESs提取液進行抗氧化能力分析。如圖5C所示,DESs提取液的DPPH·自由基清除活性呈劑量依賴性增加,IC50值為2 370 mg·L-1,DESs提取液具有一定的抗氧化作用。

A:不同濃度的提取液改善細胞活力;B:提取液降低LPS誘導炎癥模型產生的NO含量。數據表示為平均值±SEM(n=6)。C:自由基清除測試。相比于對照組,###P<0.001;相比于LPS組,***P<0.001,**P<0.01。NS為無差異圖5 提取液的抗炎和抗氧化生物活性評價A:Extracts at different concentrations enhanced the cell viabilities.B:Extracts decreased LPS-induced NO contents.C:Measurement of free radical scavenging. Data are represented as means ± SEM (n=6).###P<0.001 vs. the control group, ***P<0.001 and **P<0.01 vs. LPS group. NS means no significantFig.5 Evaluation of anti-inflammatory and anti-oxidant activity of extracts

3 結論

本文對DESs微波輔助提取連翹酯苷A的提取工藝進行優化,并與傳統提取方法進行比較,結果表明本方法大大縮短了提取時間,提高了提取效率;評價了連翹DES-4提取液的抗炎和抗氧化活性,結果顯示連翹DES-4提取液改善了細胞活性,降低了炎性因子含量,并且具有一定的抗氧化能力,且DESs提取溶劑幾乎對細胞無損傷作用。因此,本研究初步證明,DESs可用于提取連翹酯苷A。

致謝山西大學大型儀器中心賈金萍博士給予HPLC技術支持。