染色質重塑因子Brahma調控果蠅生殖細胞發育

張欣,李明發,孟和,張小民,宣濤*

(1.山西大學 生命科學學院,山西 太原 030006;2.上海交通大學 農業與生物學院,上海 200240)

0 引言

真核生物的基因表達不僅取決于基因組DNA序列本身,還在染色質結構層面上受到精確調控,這種調控即為表觀遺傳調控。表觀遺傳層面的基因表達調控在諸如細胞增殖、凋亡、命運決定與分化、干細胞及相關細胞譜系發育、組織器官的模式建成和形態發生等細胞與發育過程中的作用已日益顯現,正受到廣泛關注[1-4]。ATP依賴的染色質重塑因子通過利用ATP水解產生的能量可重新定位核小體,通過改變核小體的結構以及共價修飾組蛋白促進轉錄因子可結合到DNA區域,從而達到調控基因表達的目的[5-7]。染色質重塑因子Brahma(Brm)作為表觀遺傳因子被證實在多種細胞與發育過程中發揮重要功能,這些生物學過程涉及果蠅翅發育[8],腸干細胞增殖調控等[9]。我們的前期工作發現Brm染色質重塑復合物調控雌性果蠅生殖干細胞命運維持的實驗證據[10]。

果蠅作為理想的模式生物被廣泛地應用到發育的遺傳控制研究中,其中涉及細胞增殖及分化的雌性果蠅生殖細胞發育過程在表觀遺傳學研究中有重要價值。雌性果蠅在成蟲階段不斷產生配子,保持生殖活力與幼蟲階段性腺的正常發育密切相關。在幼蟲階段,雌性果蠅性腺包含生殖細胞和體細胞兩大譜系,其中,原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)是成蠅生殖干細胞的前體,在果蠅幼蟲發育過程中經歷了特征性的發育過程。PGC從1齡(1st instar)幼蟲開始持續增殖直至3齡幼蟲晚期(late 3rd instar larvae,LL3),數目從12個增殖至超過100個,在此期間,PGC分化始終處于被抑制狀態,而進入幼蟲向蛹轉換期(larval/pupal transition),PGC開啟適度、有序的細胞分化程序[11-12]。PGC的有序發育過程受到包括BMP信號通路[13]、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路[14-15]在內的多種信號通路及特定轉錄調控因子[16-23]調控,而表觀遺傳調控在這一發育過程中的調控功能未見報道。本研究通過果蠅遺傳學實驗方法,發現染色質重塑因子Brm參與調控雌性果蠅幼蟲原始生殖細胞有序分化過程的證據,證明表現遺傳調控在此發育過程中行使重要的調控功能。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

果蠅品系飼養過程在溫度25℃,濕度60%條件下進行。

果蠅雜交過程為挑取相應品系雌性處女蠅與相應雄性果蠅合管飼養。

果蠅品系:CantonS(CS)、w;;brm2/TM6B,Sb,Tb、w;;brmI21/TM6B,Sb,Tb、w;;brmT362/TM6B,Sb,Tb、w;;brmT485/TM6B,Sb,Tb、nos-gal4.NGT由上海交通大學李明發教授實驗室饋贈,UAS-brm-RNAi(B34520)和UAS-brm-RNAi(B31712)購于BloomingtonDrosophilastock center。

1.2 抗體及熒光染料

本論文所用抗體及熒光素染料見表1。

1.3 果蠅遺傳學實驗方法

使用Gal4UAS二元表達系統及RNAi技術,在果蠅體內進行時空特異性下調brm表達量。需將UAS-brm-RNAi品系果蠅與Gal4品系果蠅進行雜交,后代中既包含Gal4又包含UAS-brm-RNAi的果蠅即可在組織特異性增強子驅動下下調brm表達量。本研究,觀察nos-Gal4/+基因型果蠅幼蟲性腺15例,nos-Gal4>brm-RNAi基因型果蠅幼蟲性腺14例。

brm基因雜合突變果蠅制備。需要將其中一種基因型果蠅品系與配對另一種基因型果蠅品系進行雜交,后代中挑選brm基因雜合突變果蠅進行后續實驗。本研究中觀察brm2/T485基因型果蠅性腺13例,brmI21/T485基因型果蠅性腺8例,brmT362/T485基因型果蠅性腺11例。

表1 抗體和熒光素染料列表

1.4 果蠅幼蟲性腺解剖

解剖的果蠅幼蟲主要有3個時期,包括三齡幼蟲中期(ML3)、三齡幼蟲晚期(LL3)和蛹期早期(WP)。果蠅幼蟲發育時間見表2。

表2 果蠅幼蟲發育時間

發育至三齡幼蟲中期(ML3)的幼蟲仍在食物中;發育至三齡幼蟲晚期(LL3)的幼蟲大部分已經爬壁;WP時期果蠅蛹呈白色,處于正在成蛹或剛成蛹階段。蛹期果蠅已成蛹。

雌性果蠅幼蟲性腺位于其后1/3處,大約在第一體節處。解剖過程在PBS(pH=7.4)解剖緩沖液中進行。解剖時雙手各持一支解剖鑷,使用左手鑷固定幼蟲,使用右手鑷從果蠅幼蟲中間處扯開,將幼蟲后半部分的組織剖出,將消化管、氣管等多余器官剔除。性腺呈球形透明狀,位于幼蟲脂肪體中間,需仔細識別。

1.5 果蠅幼蟲性腺間接免疫熒光染色

在含有PBS(pH=7.4)解剖緩沖液中解剖出幼蟲或蛹期雌蠅性腺。熒光染色步驟如下:

(1)組織固定:于質量分數4%多聚甲醛中進行組織固定,固定時間為室溫3 min。結束后,用含質量分數0.3% TritonX-100的PBS (PBST) 洗滌3次,每次10 min。

(2)組織預滲透:染色前組織需進行預滲透,條件為含質量分數1% TritonX-100的PBS緩沖液中室溫放置1 h。

(3)組織封閉:滲透結束后,將組織移至含體積分數10%山羊血清(GS)的PBST室溫下封閉2 h。

(4)一抗染色：用封閉液將一抗稀釋到適當濃度，4℃孵育卵巢組織過夜。

(5)再次封閉:一抗染色結束后,用PBST洗滌3次,每次20 min,后將組織移至含體積分數10%山羊血清(GS)的PBST室溫下封閉1 h。

(6)二抗染色:用封閉液稀釋相對應的二抗,室溫下孵育2 h,用PBST洗滌3次,每次20 min。

(7)涂片并封片后4℃避光保存。

1.6 原始生殖細胞識別

原始生殖細胞識別使用Vasa和α-Spectrin抗體染色。用Vasa抗體標記生殖細胞,用α-Spectrin抗體標記生殖細胞中的血影小體(spectrosome)。

原始生殖細胞中血影小體為圓形,而在分化的生殖細胞中血影小體形態發生改變,兩細胞胞囊中血影小體為棒狀,四細胞胞囊中血影小體為U型,八細胞與16細胞胞囊中血影小體呈分支狀(branch)。根據血影小體形態判斷生殖細胞分化程度并進行計數。

1.7 圖像采集及處理

Nikon 80i熒光顯微鏡用于采集本研究的多色通道熒光照片。Adobe Photoshop軟件用于對采集圖片進行匯集和整理排版。

1.8 數學分析方法

秩和檢驗(MannWhitney Test)或χ2檢驗(χ2-test)用于本研究中對P值(P-values)的計算。當P<0.05時,差異顯著;當P<0.01時,差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 brm基因在雌性果蠅性腺細胞中的表達模式分析

使用Brm特異性抗體進行免疫熒光染色,檢測brm基因在果蠅幼蟲性腺組織中的表達分布模式。如圖1A所示,brm表達較為廣泛,在PGC及卵巢體細胞譜系中均有表達,其中以體細胞表達更為顯著。此外，還觀察到Brm亞細胞定位于細胞核,這樣的表達模式與其執行染色質重塑功能相關聯。

2.2 Brm調控PGC有序分化

檢測了brm的功能失活突變(loss-of-function mutations)(基因型:brm2/brmT485、brmI21/brmT485、brmT362/brmT485)對雌蠅幼蟲性腺中PGC分化程序的影響，結果顯示:brm基因突變顯著促進三齡晚期LL3性腺組織中的PGC分化。在野生型LL3性腺組織后端,PGCs開始啟動有序分化,此時免疫熒光染色可見一定比例的處于兩細胞期的分化中的PGCs;而與對照組相比,處于同一發育階段的brm純合突變型性腺不僅含有處于兩細胞期的分化中的PGCs,還可以檢測到一定比例的源于PGC分化而來、細胞數目達到8的生殖系胞囊(圖1C-1E中的箭頭；數據統計見表3,P<0.01)。這說明,Brm對控制雌蠅幼蟲期性腺中PGC的正常分化是必需的,其功能喪失可誘發PGC的過度分化。

(A) Brm的組織表達模式。抗體免疫熒光染色顯示,brm基因廣泛表達于LL3期性腺中的兩大類型細胞生殖細胞PGC及體細胞,其中,體細胞中的表達水平更高。(B-F)在野生型LL3性腺組織中,部分PGC開啟分化程序,此時可見處于兩細胞期的分化中PGCs (B);而brm純合突變顯著促進LL3期PGC的分化。突變型性腺組織中可檢測到一定比例的源于PGC分化而來的細胞數目達到4或者8的生殖系胞囊(C-E中箭頭所指)。α-Spectrin抗體染色顯示生殖細胞特有的膜性亞細胞結構Spectrosome/Fusome。依據Spectrosome/Fusome的形態及有無分叉對PGC的分化狀態進行評判。PGC分化表型的外顯率統計見圖F。圖1 染色質重塑因子Brm表達于雌蠅幼蟲性腺組織并調控PGC的分化(A) Wild type LL3 gonad stained for Brm specific antibodies.Expression of brm is evident in almost all cells of gonad, predominantly in somatic cells.(B-E) control (B) and brm (C-E) mutant gonads stained for Vasa (red) andα-spectrin (green). Control LL3 gonad carries round fusome (B).brm (C-E) mutant gonads containing cysts harboring branched fusomes (C-E, arrowhead).(F) Graph showing the percentage of brm mutant gonads containing differenting cysts.Fig.1 Brm regulate PGC differentiation

2.3 Brm以細胞自治方式參與調控PGC有序分化

使用UAS/Gal4系統和RNAi技術,選擇在性腺生殖細胞譜系中特異性表達的nanosGAL4(nos-GAL4),在生殖細胞譜系中下調brm表達量。采用免疫熒光染色方法,使用Vasa特異性抗體將生殖細胞標記,并使用α-spectrin特異性抗體標記血影小體,并根據血影小體形態判斷生殖細胞分化程度并進行計數。

結果發現在對照組性腺中PGC所含的血影小體大部分呈球形,而僅有很少部分為U型(nos-Gal4/+,6.7%,n=15)(圖2A和2A’),而生殖細胞譜系中下調brm表達的性腺中,PGC胞內均可以檢測到明顯的U型fusome,即出現了四細胞胞囊(4-cell germline cysts)的表型(nos-Gal4>brm-RNAi,100%,n=14)(圖2B和2B’),與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。這說明,生殖細胞譜系中brm表達量下調,PGC有序分化過程都受到影響,表觀遺傳調控因子Brm以細胞自治性方式參與果蠅幼蟲性腺PGC分化調控。

表3 Brm參與調控PGC分化

(A-B’)對照組雌性果蠅性腺(A-A’)和brm表達量下調(B-B’)的果蠅性腺,使用Vasa(紅色)和α-spectrin(綠色)染色。在對照組中,PGC有序分化過程正常,Fusome均為圓點狀或棒狀(A-A’),而在生殖細胞譜系(B-B’)中下調brm表達量,PGC有序分化過程受到影響,出現U型或分叉狀的Fusome(箭頭)。圖2 Brm以細胞自治方式調控PGC有序分化(A-B’) Control (A-A’) and mutant gonad expressing brm-RNAi (B-B’)under the control of specific gal4 driver stained for Vasa (red) and α-spectrin (green).Control LL3 gonad carries round fusome (A-A’). Gonads expressing brm-RNAi in germ cells (arrowhead, B-B’)result in formation of cysts harboring branched fusomesFig.2 Effect of down regulation of brm in germ cells or somatic cells on PGC differentiation

3 討論

表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下,基因表達或功能的穩定的變化,這種穩定性一般是指可以在細胞分裂時遺傳至子細胞。目前已知的表觀遺傳學變化包括非編碼小RNA調控、組蛋白修飾、染色質重塑、DNA甲基化與去甲基化等。本文選擇果蠅幼蟲性腺生殖細胞譜系的增殖與分化發育過程,研究表觀遺傳調控在此發育過程中所行使的調控功能，證明染色質重塑因子Brm參與調控雌性果蠅幼蟲原始生殖細胞有序分化；還通過在生殖細胞中特異性降低brm表達,證明其在生殖細胞中以自治性方式調控原始生殖細胞分化的調控模式。

Brm通常以復合物的形式參與調控器官發育,而果蠅中存在兩種不同的Brm復合物,即BAP(Brm-associated protein)復合物和PBAP(polybromo-containing BAP)復合物。此兩種復合物共享7個亞基,其中包括Brm、Snr1、Moiral(Mor)等,而BAP復合物特有Osa亞基,PBAP復合物包含BAP170和Ploybromo亞基[24]。Marenda等研究發現Brm以BAP復合物的形式參與調控果蠅翅發育過程中wingless信號通路下游基因的轉錄抑制[25]。我們之前的研究發現Brm參與調控雌性果蠅成體生殖干細胞的自我更新與有序分化過程是以PBAP復合物的形式完成的[10]。那么在雌性果蠅幼蟲原始生殖細胞有序分化調控過程中,哪個復合物參與其中?這是我們接下來需要研究的課題。

已有研究報道,Brm參與調控多種信號通路活性。在果蠅翅發育過程中,wingless信號通路下游基因的轉錄抑制受到Brm的調控[25]。Jin等發現Brm受Hippo信號通路調控從而在腸干細胞增殖過程中發揮重要調控作用[9]。此外,而本課題組之前的研究發現,Brm通過調控JAK-STAT信號通路活性,從而參與果蠅成體干細胞的分化過程[10]。在果蠅幼蟲性腺發育過程中,Brm參與調控何種信號通路活性,其轉錄又受到哪些信號通路的影響?這也是我們課題組未來要研究的問題。

本研究探討表觀遺傳調控在果蠅器官發育過程中的調控功能,找到ATP依賴的染色質重塑因子Brm參與調控性腺發育的實驗證據,為表觀遺傳調控參與細胞及器官發育過程提供新的證據。