細胞因子白細胞介素-17 A在鼻咽癌組織中的表達情況及臨床意義△

吳烜，童剛領，程勃然，余少康，靳楓，王樹濱#

1北京大學深圳醫院腫瘤內科，廣東深圳518036

2深圳市胃腸腫瘤轉化研究重點實驗室，廣東深圳518036

3深圳北京大學香港科技大學腫瘤研究所，廣東深圳518036

鼻咽癌是中國華南地區高發的頭頸部惡性腫瘤，世界上多數國家的鼻咽癌發病率為（0.5～1）/10萬，而廣東、廣西、湖南、福建、江西等南方地區鼻咽癌的發病率高達20/10萬人，發病人數約占全國總發病人數的80%[1-2]。以放化療為主的鼻咽癌治療方法已進入平臺期，針對鼻咽癌發病機制的新型系統性靶向治療受到越來越多的關注，但目前未有能夠帶來確切生存獲益的靶向藥物。病因學研究顯示，鼻咽癌的發病與EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染密切相關[3]。循環中的EBV DNA來源于腫瘤細胞，且能夠反映腫瘤負荷，與腫瘤的臨床分期、預后及療效緊密相關[4]。本課題組前期研究證明鼻咽癌中EBV感染可致γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等細胞因子的表達水平升高，而IFN-γ又可上調腫瘤細胞中程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）的表達，從而引起免疫逃逸，影響患者預后[5]。白細胞介素（interleukin，IL）-17A是一種由輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）產生的促炎細胞因子。研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌、大腸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中，IL-17A具有促進腫瘤發生及發展的作用[6-7]。另有研究顯示，IL-17A在EBV陽性胃癌中呈高表達，EBV可增強IL-17A的表達[8]。基于此，本研究通過免疫組織化學染色方法對鼻咽癌組織及癌旁組織中IL-17A的表達情況進行檢測，并分析鼻咽癌組織中IL-17A表達情況與患者臨床特征、預后及PD-L1表達的關系，旨在探討其在鼻咽癌發生發展中的作用，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年10月至2018年10月于北京大學深圳醫院、中山大學腫瘤醫院、中山大學第五醫院確診的90例鼻咽癌患者。納入標準：①經病理檢查確診為鼻咽癌；②術前未行激素治療、化療、放療等；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②存在精神疾病或凝血功能障礙；③年齡＜18歲；④正在參與其他研究。90例患者中，男67例，女23例；年齡34～73歲，平均年齡（55.09±8.46）歲；分化程度：高分化28例，中分化45例，低分化17例；臨床分期：I期8例，Ⅱ期24例，Ⅲ期39例，Ⅳ期19例。收集患者的鼻咽癌組織標本90例和癌旁組織標本90例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用甲醛溶液固定組織標本，石蠟包埋，連續切片（厚度為4 μm），常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，常規脫蠟，微波抗原修復，滴加10%山羊血清（封閉組織內非特異性抗原），并加入適量的兔抗人IL-17A和PD-L1抗體，4℃冰箱內孵育24 h，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）替代一抗作為陰性對照。于次日滴加適量的生物素標記的羊抗兔二抗，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察，以試劑盒提供的陽性標本作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學染色方法結果判讀

IL-17A、PD-L1蛋白陽性表達主要位于細胞膜及細胞質中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。于400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察視野內陽性細胞計數和總細胞計數，通過半定量積分法進行判定。依據染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據陽性細胞比例評分：陽性細胞比例≤5%為0分，5%＜陽性細胞比例≤25%為1分，25%＜陽性細胞比例≤50%為2分，50%＜陽性細胞比例≤75%為3分，陽性細胞比例＞75%為4分。將上述兩項評分相乘，0分代表陰性（-），1～4分代表弱陽性（+），5～8分代表中等陽性（++），9～12分代表強陽性（+++）。

1.4 觀察指標

收集患者的一般資料，主要包括年齡、性別、臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV狀態。比較鼻咽癌組織及癌旁組織中IL-17A的陽性表達率，分析不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的表達情況，以及鼻咽癌組織中IL-17A與PD-L1表達的相關性。分析IL-17A陽性和陰性患者的總生存情況和無進展生存情況。

1.5 隨訪方法

采用電話及門診方式對患者進行隨訪，隨訪截止時間為2020年4月，記錄患者的預后情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，-組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（x±s）表示；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗；采用Spearman相關分析法進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織和癌旁組織中IL-17 A陽性表達率的比較

IL-17A蛋白表達于細胞膜和細胞質，陽性顆粒為棕褐色或者棕黃色（圖1）。鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達率為62.22%（56/90），高于癌旁組織的12.22%（11/90），差異有統計學意義（χ2=48.144，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A表達情況的比較

不同年齡、性別鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV陽性情況鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A表達情況的比較（n=90）

2.3 鼻咽癌組織中IL-17 A與PD-L 1表達的相關性

90例鼻咽癌組織中，PD-L1陽性52例，陰性48例。PD-L1陽性患者的IL-17A陽性表達率為90.38%（47/52），明顯高于 PD-L1陰性患者的18.75%（9/48），差異有統計學意義（χ2=51.982，P＜0.01）。Spearman相關分析結果顯示，鼻咽癌組織中PD-L1與IL-17A的表達呈正相關（r=0.576，P＜0.05）。（表2）

表2 鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17 A和PD-L 1的表達情況

2.4 生存情況的比較

隨訪時間為3～78個月，90例患者均未失訪。IL-17A陽性患者的中位生存期為28.5個月，短于IL-17A陰性患者的44.7個月，差異有統計學意義（χ2=4.311，P＜0.05）。IL-17A陽性患者的中位無進展生存期為22.9個月，短于IL-17A陰性患者的39.8個月，差異有統計學意義（χ2=4.239，P＜0.05）。（圖2、圖3）

圖2 IL-17 A陽性（n=56）與IL-17 A陰性（n=44）患者的總生存曲線

圖3 IL-17 A陽性（n=56）與IL-17 A陰性（n=44）患者的無進展生存曲線

3 討論

在腫瘤微環境中，腫瘤細胞受到天然免疫和獲得性免疫的免疫監視。該區域存在豐富的炎性細胞因子，協調抗腫瘤免疫平衡。然而，腫瘤細胞也“劫持”了炎癥通路（適應性信號通路），通過增強PD-L1的表達抑制抗腫瘤免疫，并為腫瘤的發展創造有利條件[9]。例如，為了避免T細胞攻擊，腫瘤細胞采用干擾素（interferon，IFN）-g/JAK激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導及轉錄激活因子1（signal transduction and activator of transcription 1，STAT1）途徑增加PD-L1mRNA 的表達[10]。IFN-γ是由T細胞和自然殺傷細胞產生的一種促炎細胞因子，能夠增強主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的表達，促進腫瘤細胞呈遞新抗原。腫瘤細胞中表達的PD-L1通過IFN-g/JAK/STAT1途徑滅活細胞毒性T細胞，減弱腫瘤微環境中的免疫監視。有研究報道，其他炎性細胞因子也可誘導腫瘤細胞或腫瘤相關間質細胞中PD-L1mRNA的表達，如Toll樣受體3（Tolllike receptor 3，TLR3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IFN-α/β、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 IL-4/6/17/27 以及趨化因子CXCL9/10/11、CCL20等[11]。

IL-17是一種由Th17細胞產生的促炎細胞因子，其他類型的細胞也產生這種細胞因子，包括第3組固有淋巴樣細胞（innate lymphoid cell 3，ILC3）、γδT細胞、不變的自然殺傷T細胞、淋巴組織誘導因子樣細胞和自然殺傷細胞等[12]。研究表明，IL-17A在多種腫瘤中表達升高，參與腫瘤的發生發展[7]。而EBV陽性腫瘤的主要特征是明顯的炎性浸潤，主要由CD8+或CD4+T細胞組成。腫瘤組織中的EBV狀態與炎性因子的水平密切相關。van Beek等[13]檢測了28例EBV陽性腫瘤患者和34例EBV陰性腫瘤患者血漿中92種免疫相關蛋白的水平，結果發現8種炎性因子的表達水平與EBV陽性有關，其中包括IL-17A。本研究結果顯示，IL-17A主要表達于鼻咽癌組織的細胞膜及細胞質中，且在鼻咽癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織；IL-17A表達水平也與EBV感染有關，提示其在EBV陽性的腫瘤微環境中發揮重要作用。

IL-17可通過促進腫瘤發生、血管生成和腫瘤轉移，導致患者預后較差。IL-17可以上調血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）和血管內皮生長因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGFD）的表達，誘導淋巴管生成和血管生成，從而導致腫瘤轉移[14]。另有研究表明，IL-17可激活Src促進癌變[15]。其中一個主要的Src激活途徑是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路，它誘導核因子κB抑制劑（inhibitor of nuclear factor-κB，I-κB）磷酸化，激活致癌蛋白鼠雙微體 2（mouse double minute 2，MDM2），阻斷p53信號通路。而激活的PI3K/AKT信號通路也阻斷了抑制細胞凋亡通路的Fas相關死亡結構域蛋白[16]。此外，IL-17還可誘導促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活化，MAPK家族主要由p38MAPK、胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和Jun激酶（Jun kinase，JNK）三個級聯信號通路組成，JNK在多種惡性腫瘤的發生發展中具有重要作用[17-18]。本研究結果顯示，不同臨床分期、組織分化程度、T分期、N分期、EBV陽性情況鼻咽癌患者鼻咽癌組織中IL-17A的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。生存分析結果顯示，IL-17A陽性患者的中位生存期和中位無進展生存期均短于IL-17A陰性患者（P＜0.05）。提示IL-17A在鼻咽癌的發生發展中具有一定的促進作用。

既往研究顯示，IL-1與腫瘤免疫抑制相關，可通過誘導骨髓來源的抑制性細胞，刺激促炎細胞因子如 IL-6、TNF-β和IFN-γ的表達，與之共同發揮作用，從而抑制機體的免疫防御系統，導致腫瘤生長[19]。有研究發現，IL-17可誘導卵巢癌細胞中PDL1及其相關因子IL-6、信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的表達，是卵巢癌預后不良的潛在生物標志物[20]。本研究結果顯示，PD-L1陽性患者的IL-17A陽性表達率明顯高于PD-L1陰性患者（P＜0.01），且鼻咽癌組織中PD-L1與IL-17A的表達呈正相關（P＜0.05）。上述結果表明IL-17A可能參與鼻咽癌的免疫逃逸，導致腫瘤進展。然而其具體的作用機制仍需要通過建立鼻咽癌動物模型進行深入研究。

綜上所述，IL-17A在鼻咽癌組織中的陽性表達率較高，其表達情況與EBV感染、PD-L1表達情況、臨床分期、組織分化程度及預后有關，IL-17A可能通過影響宿主免疫或腫瘤微環境參與鼻咽癌的免疫逃逸，導致腫瘤進展。IL-17可作為預測鼻咽癌患者預后和PD-L1表達情況的潛在生物標志物，并可能成為治療的新靶點。