普魯卡因通過調節SRY相關高遷移率族盒蛋白 9抑制乳腺癌細胞增殖并誘導凋亡的機制研究

方潔，朱建坡，張虎，呂志峰#，張淑香

河南中醫藥大學第一附屬醫院1麻醉科，2血液腫瘤科，鄭州450000

乳腺癌是常見的婦科惡性腫瘤，僅2015年世界乳腺癌新發病例高達240萬，死亡52萬，是女性癌癥死亡的主要原因[1]。目前，乳腺癌的臨床治療主要包括外科手術治療及放療、化療、靶向治療、內分泌治療等，其中以乳腺癌根治切除術、改良根治術、擴大根治術、保乳術等手術治療為主[2-3]。但患者經治療后易出現不同程度的并發癥，如焦慮、抑郁、身體機能下降及化療誘發的上肢淋巴水腫、惡心嘔吐、周圍神經病變、失眠等，且晚期乳腺癌易轉移至肝臟、骨、淋巴等周圍正常組織，極難治愈，嚴重影響患者預后及生活質量[4-5]。麻醉藥在腫瘤治療中被廣泛應用，近年來研究表明，阿片類麻醉藥物、瑞芬太尼、舒芬太尼等麻醉藥物有助于減少不良反應，改善患者術后恢復及預后[6-7]。其中，普魯卡因（procaine，PCA）已被證實能夠通過阻滯細胞周期抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞活力，同時降低細胞遷移能力[8]。研究表明用PCA溶液對乳腺癌改良根治術術中皮瓣創面進行熱濕敷可以降低皮瓣壞死發生率[9]。異丙酚聯合PCA在治療乳腺癌時有麻醉誘導快速和維持平穩等良好效果，有利于患者術后恢復[10]。PCA還可抑制人胰腺癌PANC-1細胞[11]、肝癌HepG2細胞[12]的增殖。鹽酸PCA能降低脾相關酪氨酸激酶（spleen associated tyrosine kinase，SYK）基因啟動子區域CpG島甲基化從而降低結腸癌發生率[13]。基于以上研究，本研究以人乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，通過使用不同濃度PCA干預細胞并檢測細胞增殖、凋亡及細胞中SRY相關高遷移率族盒蛋白9（SRY-related high-mobility group box 9，SOX9）基因表達情況，探討PCA對人乳腺癌MCF-7細胞增殖和凋亡的影響及其潛在作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF-7細胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自美國Thermo Fisher公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）液、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自北京Solarbio公司；TaKaRa反轉錄試劑盒、TaKaRa實時熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒均購自美國Coulter公司；兔抗SOX9和β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）均購自Abcam公司；Control siRNA、SOX9 siRNA由山東維真生物科技有限公司設計合成；pcDNA-SOX9過表達載體由金瑞斯生物科技公司構建。MCO-18AC型CO2培養箱購自日本SANYO公司；CFX96 Touch TM熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測系統、ChemiDoc TM MP凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀購自上海創萌生物科技有限公司；HBS-1096B型酶標儀購自南京德鐵實驗設備公司。

1.2 細胞培養、轉染與分組

人乳腺癌MCF-7細胞使用含15%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，每天更換新鮮培養基。將對數生長期的細胞使用0.25%胰蛋白酶消化后重懸，以1×105/孔接種至24孔板，待細胞生長至融合度約45%，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書分別將Control siRNA（記為si-con組）、SOX9 siRNA（記為si-SOX9組）、pcDNA空載體、pcDNA-SOX9過表達載體轉染至MCF-7細胞，轉染pcDNA空載體、pcDNASOX9過表達載體的細胞培養液中加入PCA并調整終濃度為10.0 mmol/L，繼續培養48 h，分別記為PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX9組。

取對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞消化后接種于24孔板（1×105/孔）培養，DMEM培養液培養24 h后，吸去原培養液，分為Control組、不同濃度PCA處理組、PCA組，Control組不添加PCA，不同濃度PCA處理組PCA濃度分別為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L，PCA組PCA終濃度為10.0 mmol/L。每組3個復孔，實驗重復3次。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

分別在不同濃度PCA處理組、Control組、PCA組、si-con組、si-SOX9組、PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX9組細胞培養24、48、72 h時加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續孵育4 h；吸除多余培養基，加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，然后用酶標儀檢測490 nm處光密度（optical density，OD）值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取不同濃度PCA處理組、Control組、PCA組、si-con組、si-SOX9組、PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX9組生長狀態良好的細胞，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化細胞，離心收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，在含MCF-7細胞的24孔板中分別加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測SOX 9 mRNA表達情況

收集不同濃度PCA處理組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。分別使用TaKaRa反轉錄試劑盒和TaKaRa熒光定量試劑盒，將RNA反轉錄為cDNA。按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說明書進行qRT-PCR方法擴增。循環條件為95℃30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環；60 ℃延長5 min。以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，實驗結果以2-△△Ct表示相對表達量。β-actin引物：正向，5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3'，反向 ，5'-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3'；SOX9引物：正向，5'-CAGAAGTACTGGGAAAGTCGT-3'，反向，5'-CCGGTACTTGTAGTTGGGGTAGT-3'。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測SOX 9蛋白表達情況

收集不同濃度PCA處理組、Control組、PCA組、si-con組、si-SOX9組、PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX9組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDSPAGE）后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入兔抗SOX9（1∶1000）和β-actin（1∶1000）多克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；ECL發光顯影，每個蛋白樣品重復3次。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PCA對MCF- 7細胞增殖的影響

培養48、72 h時，隨著PCA濃度增加，MCF-7細胞OD490值逐漸下降（P＜0.05）。（表1）

2.2 不同濃度PCA對MCF- 7細胞凋亡的影響

以不同濃度PCA干預MCF-7細胞48 h顯示，2.5 mmol/L組、5.0 mmol/L組和10.0 mmol/L組MCF-7細胞凋亡率分別為（12.83±1.31）%、（21.08±2.27）%、（36.34±3.45）%，均高于 0 mmol/L 組的（7.21±0.85）%，差異均有統計學意義（t=10.797、17.166、24.595，P＜0.05），并且細胞凋亡率隨PCA濃度的增加而提高（F=296.425，P＜0.05）。（圖1）

表1 不同時間點不同濃度PCA組MCF- 7細胞OD490值的比較（± s）

表1 不同時間點不同濃度PCA組MCF- 7細胞OD490值的比較（± s）

注：a與0 mmol/L組比較，P＜0.05；b與2.5 mmol/L組比較，P＜0.05；c與5.0 mmol/L組比較，P＜0.05

48 h 0.81±0.07 0.67±0.06a 0.52±0.05a b 0.40±0.06a b c 78.411 0.000 0.53±0.03 0.51±0.04 0.46±0.04 0.34±0.04a b c 45.895 0.000 1.55±0.12 1.23±0.10a 0.72±0.04a b 0.48±0.03a b c 314.097 0.000 0 mmol/L組2.5 mmol/L組5.0 mmol/L組10.0 mmol/L組F值P值24 h 72 h組別

圖1 流式細胞儀檢測MCF- 7細胞凋亡情況

2.3 不同濃度PCA對MCF- 7細胞中SOX 9表達情況的影響

以 2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、10.0 mmol/L濃度的PCA干預MCF-7細胞48 h后，隨著PCA濃度增加，SOX9mRNA及SOX9蛋白水平均逐漸下降（P＜0.05）。（圖2、表2）

圖2 Western blot法檢測不同濃度PCA組MCF- 7細胞中SOX 9蛋白表達情況

表2 不同濃度PCA組MCF- 7細胞中SOX 9 mRNA及SOX 9蛋白表達情況的比較（±s）

表2 不同濃度PCA組MCF- 7細胞中SOX 9 mRNA及SOX 9蛋白表達情況的比較（±s）

注：a與0 mmol/L組比較，P＜0.05；b與2.5 mmol/L組比較，P＜0.05；c與5.0 mmol/L組比較，P＜0.05

組別0 mmol/L組2.5 mmol/L組5.0 mmol/L組10.0 mmol/L組F值P值1.00±0.06 0.64±0.07a 0.42±0.06a b 0.30±0.05a b c 233.096 0.000 0.91±0.05 0.73±0.06a 0.48±0.05a b 0.24±0.04a b c 301.882 0.000 SOX9 mRNA SOX9蛋白

2.4 沉默SOX 9表達對MCF- 7細胞增殖和凋亡的影響

si-SOX9組MCF-7細胞中SOX9蛋白表達量及OD490值均低于si-con組，凋亡率高于si-con組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖3、表3）

圖3 Western blot法檢測Control組、si-con組、si-SOX 9組MCF- 7細胞中SOX 9蛋白表達情況

表3 Control組、si-con組、si-SOX 9組MCF- 7細胞SOX 9蛋白表達、OD490值及凋亡率的比較（±s）

表3 Control組、si-con組、si-SOX 9組MCF- 7細胞SOX 9蛋白表達、OD490值及凋亡率的比較（±s）

注：*與si-con組比較，P＜0.05

組別Control組si-con組si-SOX9組F值P值SOX9蛋白0.89±0.06 0.85±0.07 0.36±0.06*194.355 0.000 OD490值24 h 0.51±0.04 0.52±0.05 0.39±0.04*24.790 0.000 48 h 0.84±0.07 0.80±0.07 0.47±0.05*90.512 0.000 72 h 1.58±0.12 1.47±0.11 0.64±0.07*227.092 0.000凋亡率（%）6.96±0.92 7.80±1.13 24.11±2.68*271.210 0.000

2.5 過表達SOX 9對MCF- 7細胞增殖和凋亡的影響

以10 mmol/L PCA干預的PCA組MCF-7細胞中SOX9蛋白表達量及OD490值均低于Control組，凋亡率高于Control組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。PCA+pcDNA-SOX9組MCF-7細胞中SOX9蛋白表達量及OD490值均高于PCA+pcDNA組，凋亡率低于PCA+pcDNA組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖4、表4）

圖4 Western blot法檢測Control組、PCA組、PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX 9組MCF- 7細胞中SOX 9蛋白表達情況

3 討論

目前手術切除仍然是乳腺癌的主要治療手段，在不斷的臨床研究中發現，麻醉藥物對腫瘤細胞生長、轉移和復發有一定影響[14]。PCA是常用的局部麻醉藥物之一，能夠通過抑制細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白E（cyclin E）及胞外信號調 節 激 酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）的磷酸化，從而抑制ERK/MAPK信號通路，減少結腸癌細胞增殖和遷移并促進細胞凋亡，反之，激活ERK/MAPK信號通路可逆轉PCA對細胞增殖、遷移和凋亡的誘導作用[15]。據報道，PCA可抑制DNA甲基化轉移酶活性，降低基因啟動子區的DNA甲基化水平（DNA異常甲基化是腫瘤早期發生發展的標志之一），同時抑制胃癌細胞增殖并誘導凋亡，具有腫瘤抑制作用[16]。但不同劑量不同細胞中PCA的效果不同，如在結腸癌細胞中，劑量過高的PCA上調DNA甲基化水平并促進細胞增殖[17]。PCA對不同類型腫瘤細胞的生長的影響需進行更多研究。本研究通過使用不同濃度PCA處理MCF-7細胞后發現，細胞增殖能力受到抑制，同時凋亡率增高，均呈濃度依賴性；此外，PCA對細胞中SOX9mRNA和蛋白的表達也具有抑制作用，這一抑制作用隨PCA濃度的增加而增強。

SOX基因家族是一類含有高度保守的DNA結合區域高遷移率組蛋白（high mobility group，HMG）結構域的轉錄因子家族，根據HMG序列同源性可分為8個亞族（A～H），各成員之間存在相互協同的功能[18]。其中，SOX9被發現于骨骼發育缺陷患者體內，定位于人染色體17q24.1～q25.1，可編碼509個蛋白，在胚胎發育、軟骨細胞分化、器官發育、男性性發育中起重要作用[19-20]。多項研究表明，SOX9在肝癌、非小細胞肺癌等多種人類腫瘤組織中高表達，其表達水平與患者預后、總體生存率存在顯著相關性，SOX9的高表達水平能夠促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間充質轉化，從而促進腫瘤轉移[21-22]。此外，Huang和Guo[23]研究發現，SOX9在甲狀腺癌組織及其細胞系中表達上調，通過沉默SOX9表達可有效降低細胞中cyclin D1、c-myc和β-連環蛋白表達量，從而抑制細胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間充質轉化過程。而在乳腺癌中，已有研究證實，采用RNAi技術沉默SOX9表達可顯著抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，減少細胞克隆形成，過表達SOX9可逆轉miRNA-133b對細胞生長和轉移的抑制作用[24]。本研究將SOX9 siRNA轉染至MCF-7細胞后發現，細胞增殖受到抑制，這一結果與文獻結論一致，并且能夠促進細胞凋亡；而將pcDNA-SOX9過表達載體轉染至MCF-7細胞進行預處理，可減弱PCA對細胞增殖的抑制和凋亡的誘導作用。

表4 Control組、PCA組、PCA+pcDNA組、PCA+pcDNA-SOX 9組MCF- 7細胞SOX 9蛋白表達、OD490值及凋亡率的比較（x-±s）

綜上所述，PCA能夠抑制MCF-7細胞增殖并促進細胞凋亡，可能是通過調節SOX9表達完成，提示SOX9可能是乳腺癌治療的新靶點；PCA和SOX9在乳腺癌中的具體作用機制仍需進一步研究，這一研究結果有望為乳腺癌的治療提供新思路。