基于稀土發光納米材料的時間分辨成像

王 鑫 韓曉軍 陳冠英

(哈爾濱工業大學 化工與化學學院, 黑龍江 哈爾濱 150001)

1 引 言

光學成像技術通常利用外源性的熒光探針對特定的區域進行標記,同時利用靈敏的光學檢測器進行信號采集,廣泛應用于疾病診斷、生物傳感和防偽等領域[1-5]。 實現高分辨、高靈敏的光學成像關鍵在于設計優質的光學探針。 目前已經開發的光學納米材料包括無機量子點[6-7]、稀土發光材料[4,8-9]、鈣鈦礦材料[10]、碳納米管[11]、有機染料[12]和共軛聚合物[13]等。 然而,光學成像主要的問題是受自體熒光和光散射的限制,降低了生物成像的信噪比和成像深度,從而極大程度地影響了活體檢測靈敏度和成像分辨率。 盡管最近的研究表明近紅外區生物窗口內的熒光成像技術(700 ～950 nm,第一生物窗口；1 000 ～1 700 nm,第二生物窗口)能夠在一定程度上緩解自體熒光和散射現象的影響[3,14-15],但目前報道的近紅外材料的熒光波長一般小于1 200 nm,同時難以徹底消除背景熒光干擾,且發光顏色單一,難以通過顏色實現波長可分辨的多通道復合成像。 因此,光學成像仍需開發新型的納米熒光材料,以滿足高信噪比和多通道成像的需要。

時間分辨成像技術是一種利用熒光探針的長壽命特點進行無背景光學分析的成像技術[16]。由于自體熒光信號和散射熒光信號的壽命小于熒光探針的壽命,時間分辨技術能在背景信號完全衰減之后收集探針的熒光信息,因此能避免傳統成像過程中產生的背景噪音干擾問題[17-20]。 目前,時間分辨成像技術包括時間門成像技術和在其基礎上發展的壽命編碼多通道成像技術兩種。時間門成像的本質還是熒光成像,盡管采集的衰減信號會引起熒光強度下降,但由于抑制了自體熒光和散射,其成像的信噪比得到了極大的提升[21-22]。 壽命編碼多通道成像則是對熒光壽命編碼的生物信息進行時域并行光學成像,由于壽命信號與熒光強度、采集信號的效率和是否聚焦都無關系,幾乎不受環境因素的影響,十分適用于體內的定量成像研究,而且還可同時對多個壽命信號在時域內進行平行多通道復合成像[23-24]。

稀土發光納米材料是一類優質光學材料,具有長壽命、可調諧多色發光、發射峰窄和發光穩定等特點[4,25]。 此外,稀土發光離子具有豐富的發光能級,其離子內部4f-4f 電子躍遷能產生從紫外區到近紅外區的熒光,而f-f 的禁阻躍遷使其具有較長的熒光壽命[16]。 據報道,稀土納米材料的熒光壽命能夠長達幾十微秒到幾十毫秒,遠大于生物體自源熒光和散射的熒光壽命(低于10 ns),因而非常適用于時間分辨生物熒光成像的研究。另外,稀土發光納米材料的熒光壽命可通過核殼結構[26]、摻雜濃度[27]、合成尺寸[28]、熒光共振能量轉移[19,29]等策略進行精確的調節,從而使其能在不同的時域范圍內滿足不同成像條件的需求。因此,本文對稀土發光納米材料的熒光壽命調控及其時間分辨成像的研究情況進行系統的綜述和總結,并對其未來發展進行展望。

2 稀土發光納米材料的熒光壽命調控

影響稀土發光納米材料熒光壽命的因素主要包括核殼結構、離子摻雜濃度、尺寸大小、熒光共振能量轉移和納米晶內能量遷移過程。

2.1 核殼結構

在單核稀土發光納米材料上包覆不同的殼層或可以抑制其表面猝滅和交叉弛豫,或能夠增強光的吸收和介導能量傳遞過程。 納米材料包覆的殼層通?？梢苑譃椤岸栊浴焙汀盎钚浴睔?其中“惰性”殼層是指殼層中既無激活劑也無敏化劑,主要起屏蔽能量傳遞的作用；而“活性”殼層是指殼層中存在激活劑或者敏化劑,起介導能量傳遞的作用。 本小節主要討論惰性殼層對熒光壽命的影響,而“活性”殼層部分將在2.5 中討論。

常見的惰性殼層有NaYF4、CaF2和NaLuF4,其主要作用是保護內核摻雜的敏化劑和激活劑,避免其表面缺陷、雜質和溶劑等引起發光猝滅現象。 因此,惰性外殼包覆的稀土納米材料的熒光強度和壽命相對于單核納米材料均能夠顯著增加。如圖1 所示,核殼結構納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2在808 nm 近紅外光的激發下,1 000 nm 處的熒光壽命比單核納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+增強了16 倍[26]。 此外,研究表明惰性殼層的包覆厚度也會影響稀土發光納米材料的熒光壽命。 以稀土納米材料NaYF4∶Yb3+,Er3+包覆惰性殼層NaLuF4為例,在980 nm 近紅外光激發下,隨著外層NaLuF4的厚度增加,該稀土材料在540 nm、654 nm 和1 525 nm 處的熒光壽命信號均得到與殼層厚度依賴性地增強[30]。 可見,精確調控稀土納米材料的殼層厚度可以有效調節熒光壽命。

圖1 (a)核殼結構納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2 抑制表面猝滅示意圖；(b)核殼結構納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@ CaF2 與單核納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+在1 000 nm 處的熒光衰減曲線[26]。Fig.1 (a)Schematic illustration of the NaYF4 ∶10%Yb3+,30%Nd3+ @ CaF2 core/shell nanoparticles designed to suppress the surface quenching effect.(b)Fluorescence decay curves of the emission observed at 1 000 nm from NaYF4 ∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2 core/shell nanoparticles and NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+nanoparticles[26].

2.2 離子摻雜濃度

敏化劑和激活劑是稀土發光納米材料的重要元素,敏化劑能夠吸收激發光將能量傳遞給激活劑,激活劑受到能量激發后發出熒光。 這兩種離子的摻雜濃度會影響納米晶中兩種離子之間的間距,從而影響電多極矩或磁多極矩相互作用,引起熒光壽命的改變。 金大勇等利用這個策略,通過改變不同濃度的激活劑(Tm3+離子)摻雜濃度,使稀土發光納米晶NaYF4,Yb3+,Tm3+的藍光峰(480 nm)實現了從48 μs(4%Tm3+)到668 μs(0.2%)的壽命調節[31]。 另外,敏化劑濃度差異會引起熒光壽命的改變。 如在稀土核殼材料NaY0.9-xYb0.1,NdxF4@ CaF2中通過改變Nd3+離子的摻雜比例,在808 nm 的近紅外光激發下能夠在1 000 nm 處產生0.1 ～1.5 ms 范圍的熒光壽命(圖2)[27]。

圖2 (a)6 個不同Nd3+濃度摻雜的NaYF4 ∶Yb3+,Nd3+@CaF2 核殼結構納米晶熒光衰減曲線,激發光808 nm,發射光1 000 nm；(b)NaYF4 ∶Yb,Nd@ CaF2 核殼結構納米晶熒光壽命的濃度依賴性[27]。Fig.2 (a)Fluorescence decay curves obtained for the NaYF4∶Yb3+,Nd3+ @ CaF2 core/shell nanoparticles with six different Nd3+ dopant levels. Excitation was performed at 808 nm, and the observed emission wavelength was 1 000 nm. (b)Concentration dependence of the fluorescence lifetime of the NaYF4 ∶Yb,Nd@CaF2 nanoparticles[27].

2.3 尺寸大小

隨著納米合成技術的不斷發展,稀土發光材料能夠實現從幾個納米到微米尺寸的精準制備。發光材料的尺寸會影響其發光壽命,因此通過精確制備不同尺寸的稀土納米材料可以有效調控其發光壽命。 Goldys 等制備了一系列不同尺寸的稀土發光納米晶NaYF4,Yb3+,Er3+(6 ～45 nm),并且發現這些材料的熒光壽命隨尺寸減小而降低[32]。 這是由于稀土納米發光材料的尺寸越小,其表面的非輻射能量猝滅過程越強,從而導致熒光壽命降低。 單分子水平的研究中也證實了熒光壽命信號隨著尺寸減小而逐漸降低的規律(圖3)[28]。 通常,對于尺寸小于20 nm 的納米顆粒來說,熒光壽命主要受到表面效應的影響,而對于大尺寸( ＞20 nm)的稀土發光納米材料,熒光壽命除了表面效應還會受到離子間交叉弛豫的作用。 此外,在核殼結構納米材料研究中,尺寸因素主要體現在殼層的厚度上,其熒光壽命信號隨殼層厚度增加而增強。 這主要是因為殼層越厚抑制表面無輻射躍遷的效果越好。

圖3 不同尺寸(8,30,50,150 nm)單顆粒NaYF4∶20%Yb3+,2%Er3+上轉換納米晶掃描透射電鏡圖像(a)與熒光衰減曲線(b)Fig.3 (a)Scanning transmission electron microscopy(STEM)images of single upconversion nanoparticles(UCNPs)of NaYF4∶20%Yb3+,2%Er3+ with 8, 30, 50, 150 nm diameters. (b)Luminescence decay(normalized)plotted for various UCNP diameters.

2.4 熒光共振能量轉移

稀土發光納米材料可作為能量供體與其他材料的能量受體構建成熒光共振能量轉移(Luminescence resonance energy transfer,LRET)體系,因此可通過改變能量受體濃度調節稀土發光納米材料的熒光壽命。 如陳學元等利用生物素修飾的稀土發光納米晶NaYF4∶Ce3+/Tb3+和親和素修飾的異硫氰酸熒光素酯(FITC)分別作為能量供體和受體,通過生物素與親核素特異性反應將兩者鍵合成有效的LRET 體系。 在290 nm 的紫外光激發下,Tb3+離子發出的489 nm 的熒光與FITC 的激發光490 nm 重疊并發生能量轉移,隨著親和素修飾的FITC 的濃度增加,LRET 作用不斷增強,稀土發光材料NaYF4∶Ce3+/Tb3+在489 nm 處的熒光壽命呈現受體濃度依賴性地減小[33]。 此外,熒光壽命還可以通過調節供體和受體之間的距離實現。 如將能量供體稀土Eu3+離子的復合物與受體染料(陽離子香豆素六氟磷酸鹽)封裝在聚苯乙烯微球中,隨著受體染料濃度的增加,單位體內Eu3+離子與染料的距離減小,Eu3+離子612 nm 熒光壽命實現了從359 μs 到188 μs 的調控(圖4)[29]。 熒光共振能量轉移策略對壽命調節范圍相對較小,但由于其具有特別的偶聯機制,適用特異性標記物的精確分析。

圖4 基于LRET 設計的Eu3+復合物微球的熒光壽命測量示意圖。 通過受體染料溶液濃度改變增強LRET效應時,Eu3+復合物微球紅光的熒光壽命減小。 插圖是單個Eu3+復合物微球熒光衰減信號[29]。Fig.4 Lifetime measurements from individual Eu-containing microspheres engineered by LRET scheme. Luminescence lifetime measured at Eu3+ red emission band shortened as the acceptor concentration in the original dye solution increased, as a result of stronger LRET effect. The inset curves are the luminescence decay signals measured from single Eu-LRET microspheres[29].

2.5 控制納米晶內能量遷移過程

除了調控兩種熒光物質之間的能量轉移,熒光壽命還可以通過稀土材料內部的能量傳遞進行調控。 張凡課題組報道了一種通過在多層核殼結構中控制能量傳遞的策略調控稀土離子的熒光壽命。在稀土上轉換納米材料NaGdF4∶25%Yb,1%Tm@NaYF4∶10%Yb@NaNdF4∶10%Yb@NaYF4中,Yb3+離子是能量傳遞的重要中轉離子,隨著能量中轉層NaYF4∶10%Yb 厚度由1.5 nm 增加到5.4 nm,多層核殼結構納米晶的475 nm 藍光壽命由632 μs 增加到836 μs[19]。

此外,該課題組還開發了一系列不同熒光壽命的近紅外二區多層核殼結構納米晶NaGdF4@NaGdF4∶Yb,Er@NaYF4∶Yb@NaNdF4∶Yb。該稀土納米晶不僅能通過增加能量中轉層(NaYF4∶Yb)厚度上調1 525 nm 的熒光壽命信號(圖5(a)),還能以提高發光中心Er3+離子的摻雜濃度下調1 525 nm 的熒光壽命信號(圖5(b)),從而實現了從5.8 μs 到20.9 ms 范圍的熒光壽命調節[20]。可見,各種熒光壽命的調控策略不是完全獨立的,它們之間往往相互聯系,因此開發可調諧的長熒光壽命探針需要綜合考慮采用多種方法。

總之,在這些調控熒光壽命的方法中,調節離子摻雜濃度是最容易實現的調控策略,但需要考慮濃度猝滅等因素,因此需要通過包覆惰性殼層以減少濃度猝滅的影響。 在調節尺寸的方案中,單核納米晶的合成可控性有限,不過通過構建核殼結構納米晶可打破這一限制,以改變殼層的厚度控制尺寸進而調控壽命。 熒光共振能量轉移策略能對壽命進行精確調控,但調節范圍較小(幾百微秒),而控制納米晶內能量遷移過程可以實現較大范圍(從微秒到毫秒)的壽命調控。

圖5 (a)能量中轉層(NaYF4 ∶Yb3+)厚度d =0 ～7 nm時,Er3+離子摻雜納米晶的1 525 nm 的熒光衰減曲線；(b)發光Er3+離子濃度為2% ～30%、d=0.9 nm 和發光Er3+離子濃度為15% ～45%、d =0 nm時,Er3+離子摻雜納米晶的1 525 nm 的熒光衰減曲線。Fig.5 (a)Luminescence decay curves measured at 1 525 nm from the as-prepared Er3+ nanoparticles with energy relay shells of increasing thickness d from 0 to 7 nm(identical composition).(b)Luminescence decay curves of the nanoparticles with incremental Er3+ doping concentration from 2% to 30% for d =0.9 nm and from 15% to 45% for d=0 nm.

3 時間門成像

時間門成像是一類直接利用衰減熒光信號進行成像的時間分辨技術。 由于熒光探針的發光壽命遠大于自體熒光或散射信號的熒光壽命,時間門成像可在脈沖激光激發后通過延遲一定時間再進行熒光信號的采集,從而屏蔽發生在該延遲時間內的背景熒光信號。 稀土發光納米材料為時間門成像的研究提供了廣泛的材料。 目前,長壽命的稀土發光納米材料已經成功應用于生物組織和微環境響應的時間門成像。

3.1 生物組織的時間門成像

與可見光(400 ～700 nm)相比,近紅外生物窗口(700 ～1 700 nm)受自體熒光和光散射的影響較小,能夠穿透厘米級的組織進行高分辨的深層成像[11,34]。 然而,當近紅外光激發時,動物體內(如皮膚、毛發)的內源性熒光基團依然能夠發出熒光,從而降低了靶向區域成像的信噪比[26,35]。為了解決這一問題,金大勇等開發了上轉換時間門成像系統,并利用長壽命的上轉換納米材料NaLuF4∶Yb3+,Tm3+實現了高對比度的時間門成像[36]。 如圖6,該時間門成像系統包括3 個部分：用來激發長壽命探針的脈沖激發光源；屏蔽激發光和短壽命熒光信號的旋轉斬波器；捕獲長壽命熒光信號的檢測器。 將水相的稀土上轉換納米材料NaLuF4∶Yb3+,Tm3+經皮下注入小鼠腹部,并將小鼠放入時間門成像系統,在980 nm 脈沖光的照射下進行時間門成像。 其結果顯示,與傳統800 nm 熒光成像相比,時間門成像的信噪比提高了一個數量級(12 倍)。 此外,筆者課題組也開發了類似的近紅外二區下轉換時間門成像系統,利用長壽命(近1 ms)的近紅外二區稀土探針用于研究小鼠的時間門成像。 我們利用聚丙烯酸修飾稀土發光核殼納米晶NaYF4∶10%Yb3+,30%Nd3+@CaF2,使其具備良好的生物相容性,并將水化壽命探針注入小鼠體內進行1 000 nm 處的時間門成像。 結果顯示小鼠的皮膚、食物和眼睛中的自體熒光和散射信號得到明顯的抑制,成像的信噪比得到了顯著的提高[26]。

由于長壽命的探針在時間門成像過程中熒光信號衰減迅速,檢測器捕獲的熒光信號通常較弱,因此可以通過增強材料的發光效率來提高衰減的熒光信號。 李富友團隊開發了一種14.5 nm 的稀土發光納米晶α-NaYbF4@CaF2作為高效壽命探針進行時間門成像研究[37]。 在短脈沖的975 nm近紅外光激發下,該高效探針能發出相同能級的975 nm 衰減熒光。 更重要的是該探針在內核中只摻入單激發態的Yb3+離子,有效避免交叉弛豫影響,并在殼層保護下突破了濃度猝滅的限制,實現了轉換效率近100%的高效近紅外發光。 將水化的長壽命探針注入到小鼠體內(13 μg·g-1),在1.1 mW·cm-2功率密度的近紅外光激發下即可觀察到信噪比大于9 的小鼠器官。 而且,在時間門成像技術幫助下,該高亮的長壽命探針能夠在荷瘤小鼠體內長期監測腫瘤的生長情況。

圖6 體內近紅外時間成像系統示意圖[36]Fig.6 Shematic illustrating the TGL system for in vivo NIR imaging[36]

3.2 微環境響應的時間門成像

體內實時監測微環境如pH、溫度和酶對生物醫學的研究十分重要。 光學成像技術提供了一種非侵入性方式在體內監測微環境變化。 然而,組織的吸收和散射限制了光信號的穿透深度,而且光信號在不同的組織存在差異,限制了其在特定組織的成像。 相對于傳統的穩態熒光成像,時間門成像能夠消除短壽命的背景噪音,提高成像信噪比,十分適合用于體內微環境的研究。 李富友團隊利用稀土發光納米材料NaYF4∶1%Tm3+@NaLuF4、染料 Rh760 和聚乙二醇化的磷脂mPEG5000-DSPE 構成pH 響應的熒光探針[38]。在690 nm 激發光激發下,NaYF4∶1% Tm3+@NaLuF4和染料Rh760 都能發出800 nm 的近紅外光。 而RH760 對pH 敏感,其熒光信號會因pH改變而發生變化。 由于兩種材料的熒光壽命不同,可在時間門成像系統中通過區別并采集同一波段不同的熒光信號,兩種材料的比率熒光信號可實現1.5 ～7 范圍的pH 響應成像。 在動物實驗中,利用時間門成像不僅能檢測胃腸區域的pH值,還能實時監測由藥物和食物消化引起的pH值變化。

溫度是生物微環境中一個重要的生理和病理指標。 如圖7,稀土上轉換發光材料(Tm-UCNPs)可與溫度敏感PbS 量子點構建成復合的上轉換納米團簇,用于體內測溫和監測腫瘤內部溫度變化[39]。 在865 nm 的近紅外光的激發下,PbS 量子點發出溫度敏感的810 nm 上轉換熒光(短壽命),而Nd3+離子敏化的Tm-UCNPs 上轉換納米晶發出穩定的810 nm 上轉換熒光作為參照(長壽命)(圖7(a))。 由于壽命不同,這兩個同波段的上轉換熒光可以通過時間分辨技術分開,因此通過采集這兩種熒光的比率可實現對溫度的測量,其熱靈敏度高達5.6%·K-1。 而且,由于該復合探針的激發光和發射光均在生物窗口內,十分適用于體內測溫。 通過修飾聚乙二醇,該復合熒光探針可用于在光熱治療過程中實時監測腫瘤溫度的變化,避免由于過熱造成的組織損傷(圖7(b))。

除了pH、溫度,稀土發光納米材料還能應用于酶響應的時間門成像。 Nazare 等開發了一種激活型稀土復合探針用于時間門成像檢測細菌中的硝基還原酶[40]。 在該研究中,喹諾酮前體包覆稀土Tb3+離子復合物在紫外光的照射下并不發光,而硝基還原酶能激活惰性的喹諾酮(鄰胺桂皮酸內酰胺)前體形成光敏感態的天線,并將能量傳遞給稀土Tb3+離子的發光中心產生550 nm 的熒光。 Tb3+離子的時間分辨光譜表明,隨著硝基還原酶濃度的增加,其在550 nm 處的可見熒光顯著增加。 而且,硝基還原酶濃度與稀土熒光探針的時間分辨光譜成良好的線性關系,其檢測限低至4.4 ng·mL-1。 在時間門成像技術的幫助下,該酶響應的稀土復合探針在顯微成像中成功分辨了臨床中的多種多重耐藥細菌,如腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬等,這十分有助于開發新型診斷細菌感染的工具。

此外,LRET 型探針在微環境響應的時間門成像研究中發揮了重要的作用。 由于LRET 的能量受體會對微環境具有特異性響應,稀土發光材料作為能量供體,在接受能量傳遞后其熒光信號會發生相應的改變,從而實現對微環境的成像?；诖?LRET 型稀土發光探針還可以應用于無機分子[41]、DNA[42]、蛋白質[43]響應的時間門成像。 如稀土Tb3+復合物與羅丹明構建的LRET 系統對溶酶體的一氧化氮(NO)敏感,當該系統與NO 反應后,時間門光譜顯示Tb3+復合物540 nm的熒光顯著減少,而羅丹明發出565 nm 的熒光明顯增加,而且二者的熒光比值與NO 濃度成線性關系。 在時間門成像中,利用該響應的復合探針可檢測出肝癌細胞(HepG2)和大型蚤中的NO[41]。

圖7 上轉換發光的納米簇用于相同波段的比率測溫示意圖。 (a)測溫機制示意圖；(b)相同波段的比率測溫在體內溫度監測示意圖[39]。Fig.7 Schematic of UCL-NCs for the same wavelength ratiometric thermometry. (a)Schematic mechanisms of the UCL-NCs.(b)Schematic illustration of the same wavelength ratiometric temperature monitoring in vivo[39].

3.3 活體定量檢測

近紅外熒光能夠穿透深層組織,然而組織對光的吸收和散射存在差異,熒光信號強度發生不同程度的衰減,阻礙了其在體內對標記物的精確檢測。 最近的研究表明,魯棒的熒光壽命信號傳感與組織深度無關,這有利于對生物體內部進行精確的量化分析。 復旦大學張凡課題組制備了一種腫瘤微環境(過氧亞硝酸鹽,ONOO-)響應的稀土-花青染料LRET 納米復合探針,用于基于壽命的原位肝癌細胞傳感(圖8(a))[23]。 在該納米復合探針中,能量供體稀土下轉換發光納米晶NaYF4@NaYF4∶1% Nd3+與對ONOO-敏感的能量受體NIR-Ⅱ 染料MY-1057 之間產生LRET 效應,導致其在1 060 nm 的熒光壽命顯著減小。 當活性氮存在時(特別是ONOO-),由于該探針中的能量受體MY-1057 被降解,復合探針的熒光壽命信號得到了恢復(圖8(b))。 基于此,利用該復合探針在肝部區域進行壽命編碼成像,不僅可以準確地區分肝癌病變和正常組織,而且還能定量檢測不同尺寸腫瘤病灶中的ONOO-。 而對于普通的熒光成像,由于納米材料在肝部的高度蓄積導致信噪比低,難以區分肝部的病變組織(圖8(c))。

類似地,Tm3+離子摻雜的稀土發光納米材料與近紅外染料IR-820 也可以構建成基于LRET的納米傳感系統用于檢測ClO-分子[44]。 在該體系中,稀土納米晶NaYF4∶Tm3+的吸收和發射都在同一能級(3H4),極大地提高了發光效率,比核殼結構納米材料(NaYF4∶20% Yb3+,1% Tm3+@NaYF4)的上轉換發光強度提高了33 倍,可作為一個高效的能量供體。 而染料IR-820 在800 nm處有很強的吸收,可作為能量受體。 由于染料IR-820 對ClO-非常敏感,易發生分解,該LRET納米傳感系統的壽命信號隨著ClO-的濃度升高而不斷增長,因此可以利用熒光壽命信號的變化測定ClO-的濃度。 此外,在關節炎的小鼠模型中,利用該探針進行壽命編碼成像可以有效地標記出炎癥區域。

此外,利用壽命成像還可以用于監測體內pH的變化。 張俊龍等通過在卟啉上引入羧酸鹽制備了稀土Yb3+離子卟啉復合物作為pH 敏感的壽命探針[45]。 在pH =9.0 ～5.0 的生理環境下,該探針在900 ～1 100 nm 范圍的熒光壽命信號隨pH的減小而呈依賴性地增加(從13. 4 μs 增大到135 μs)；而在pH ＜5 的環境下,該探針會發生團聚,造成溶解度下降致使Yb3+離子復合物從水中暴露出來,當pH 從5.0 降到1.0 時,熒光壽命依然呈隨pH 減小而依賴性增加(從135 ms 增加到170 ms)。 在小鼠口腹灌胃實驗中,利用該pH 探針進行時間壽命編碼成像可以實時監測小鼠體內正常代謝、禁食和服用鋁碳酸鎂藥物時的pH 變化。 然而,該探針使用的激發波段在可見區(500 ～600 nm),其穿透深度方面存在明顯的不足。 因此,仍需要開發近紅外激發/發射的壽命探針,用于實現對體內的生理和病理環境的定量可視化分析,這將在臨床診斷和治療方面具有很大的應用潛力。

圖8 在NIR-Ⅱ區進行基于壽命的原位肝癌細胞傳感示意圖。 (a)ONOO -敏感型傳感器：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)修飾NaYF4@NaYF4∶1%Nd 與MY-1057 復合物(DSNP@ MY-1057-GPC-3)；(b)ONOO - 存在時能量受體染料MY-1057 敏感地降解,導致NIR-Ⅱ區熒光壽命恢復；(c)利用DSNP@MY-1057-GPC-3 探針對肝細胞癌小鼠進行非侵入的NIR-Ⅱ熒光信號和壽命信號成像[23]。Fig.8 Schematic illustration of lifetime-based detection of hepatocellular carcinoma(HCC) in the second near-infrared(NIR-Ⅱ) window. (a)Scheme of the ONOO --responsive nanosensor DSNP@ MY-1057-GPC-3. (b)In the presence of ONOO -, the structure of the energy acceptor MY-1057 degrades sensitively, leading to the lifetime recovery in NIR-Ⅱregion. (c)Illustration of noninvasive NIR-Ⅱintensity- and lifetime-based imaging for HCC mice after administration of DSNP@MY-1057-GPC-3 nanosensor[23].

4 壽命編碼多通道成像

壽命編碼成像是利用不同熒光壽命信號作為密碼進行成像的時間分辨技術。 在壽命編碼成像中,目標分子與壽命編碼的熒光探針特異性結合后可獲得該探針的壽命信息,通過對圖像的數據處理可解碼標記物的壽命信息,從而實現目標分子的特異識別。 壽命編碼的多通道成像則能利用多個壽命信號對不同標記物同時進行分析,實現生物檢測中的高通量分析或防偽領域的高階加密。 稀土發光納米材料具有可調諧的長壽命,便于產生多個穩定的編碼壽命信號進行時域多通道復合成像,并在最近得到了學術界廣泛的關注。

圖9 壽命編碼防偽文件及儲存的光學信息。 3 種不同的圖像疊加成一個混合圖片,其中Tm 壽命探針(CYb∶CTm)20∶4 是麥考瑞大學的標志,20∶4代表悉尼歌劇院,20∶0.5 代表悉尼海港大橋。 (a)熒光成像顯示的復合圖片；(b)根據像素壽命成分進行時間分辨掃描顯示的分離圖片[29]。Fig.9 Demonstration of lifetime-encoded document security and photonic data storage. Three overlapping patterns are printed with different Tm τ-dots： (CYb∶CTm) 20∶4 for the ‘Macquarie University’ logo, 20∶1 for the Sydney Opera House image, and 20∶0.5 for the Sydney Harbour Bridge image. (a)Intensity-based luminescence imaging gives a complex picture.(b)Timeresolved scanning separates the patterns based on the lifetime components of every pixel[29].

金大勇課題組在稀土多壽命編碼的復合成像方面做了早期的研究工作。 他們利用具有不同壽命的稀土上轉換納米晶NaYF4∶Yb3+,Tm3+進行了多級防偽的研究[31]。 在該研究中,將3 種壽命(τ=52,159,455 μs)的稀土上轉換納米晶NaYF4∶Yb3+,Tm3+制成防偽墨水,在同一張紙上依次噴涂上3 種不同的圖形進行加密設置。 利用常規Tm3+475 nm 藍光信號下進行成像只得到了一個模糊的圖像(圖9(a)),而利用壽命信號進行編碼的復合成像卻可以清晰地分辨這3 種圖形(麥考瑞大學、悉尼歌劇院和悉尼海港大橋)(圖9(b))。 該研究提供了一種安全的加密防偽策略,以不同壽命的防偽墨水對文件進行加密,只有知道正確解碼規則才能獲得密碼信息。 此外,他們還利用4 種不同壽命的稀土Eu3+離子的微球(R-315,R-276,R237 和R-118,R 代表Eu3+離子發出的612 nm 的紅光)分別偶聯靶向核酸,用于檢測不同病菌的單鏈DNA[29]。 在同一檢測樣品中,時間分辨正交掃描顯微系統能同時采集多個Eu3+離子復合物微球的時域熒光。 通過對復合圖像解碼可以有效地鑒別人體免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒(EV)、乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒16(hpv 16)4 種病毒的單鏈DNA。 因此,多壽命編碼的復合成像避免了傳統熒光信號產生交叉干擾的問題,實現了高通量體外檢測生物樣本。

近期,筆者課題組利用不同的稀土壽命探針進行了活體多通道復合成像研究。 我們將兩種不同壽命編碼的稀土核殼結構納米材料NaYF4∶Yb,Nd@CaF2分別以口服和尾靜脈注射注入小鼠體內。 在980 nm 處的近紅外熒光壽命成像結果顯示長壽命的稀土探針(τ=1.3 ms)富集在肝部,而短壽命的稀土探針(τ=0.7 ms)富集在胃部。 體內的多路壽命復合成像能精確地分辨不同壽命的納米探針,并追蹤了它們不同的生物分布途徑[27]。 在應用兩個壽命的信號進行成像的基礎上,我們還開發了一系列可調諧壽命(78 ～2 157 μs)的上轉換納米發光材料NaYF4@ NaYbF4@NaYF4∶Yb3+/Tm3+@ NaYF4,用于體內的時域多通道上轉換復合成像[24]。 體內多通道成像中,3種壽命的上轉換探針以尾靜脈和皮下的方式注入小鼠體內,在980 nm 近紅外脈沖光激發下,800 nm 處的熒光壽命編碼復合成像可以有效地分別出肝部(τ5=1 158 μs)和腹部皮下組織(τ2=920 μs,τ9=1 528 μs)的壽命著色(圖10)。

此外,復旦大學的張凡課題組在利用稀土發光壽命進行多路復合成像方面也做出了重要貢獻。 在可見區的研究中,3 種顏色(藍綠紅)的上轉換納米材料(NaGdF4∶Yb3+,Ln3+@NaYF4∶Yb3+@NaNdF4∶Yb3+@NaYF4,Ln=Tm,Er/Pr,Er)可分別通過多層核殼結構和控制能量傳遞調控出不同壽命的信號,具有很強的編碼能力[19]。 將不同壽命和顏色的上轉換納米材料封裝在多孔聚苯乙烯微球中,并分別修飾上9 種人乳頭瘤病毒(HPV16,18,31,33,35,39,45,51,68)的DNA 探針,在多壽命編碼的復合成像中,根據壽命和顏色不同可分辨出這9 種高風險的HPV。 在近紅外區的研究中,3 種壽命(τ=0.553,1.73,7.21 ms)的稀土下轉換納米材料NaGdF4@NaGdF4∶Yb3+,Er3+@NaYF4∶Yb3+@NaNdF4∶Yb3+分別偶聯3 種乳腺癌標記物的抗體,用于不同腫瘤分型的鑒定和分析[20]。 將抗體標記的壽命編碼探針經尾靜脈注入腫瘤小鼠體內,采集多個近紅外二區1 525 nm 的熒光壽命信號進行編碼復合成像。 該熒光壽命的復合成像結果顯示雌激素受體(ER)、黃體酮受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)3 種標記物在MCF-7 腫瘤中的表達分別為62. 3%、17.9% 和19.8%,而在BT-474 腫瘤中的表達為25. 4%、28%和46.6%,因此可以判斷出在不同的腫瘤細胞中3 種腫瘤標記存在表達差異。 可見,高通量的復合編碼成像能夠在活體中鑒別和檢測多種分子樣品,有可能成為核酸分析、蛋白鑒定和臨床診斷的一種新型重要工具。

圖10 體內時域多通道復合上轉換成像：(a)將納米顆粒注入小鼠,并利用自制的時間分辨系統進行上轉換成像示意圖；(b)聚丙烯酸(PAA)包覆的τ2、τ5 和τ9 3 種壽命的多核殼結構納米晶的上轉換熒光衰減曲線；(c)將PAA 包覆的τ2 和τ9兩種壽命的多核殼結構納米晶皮下注入昆明小鼠腹部,進行上轉換熒光成像(左上)和壽命成像(右上)。 在第二只昆明小鼠中(下),除了皮下注τ2 和τ9納米晶外,還通過尾靜脈注入PPA 包覆的τ5 納米晶,進行內部器官上轉換熒光成像(左下)和上轉換壽命成像(右下)。 τ 壽命值與(b)中的納米顆粒一致[24]。Fig.10 Temporal multiplexed in vivo upconversion imaging. (a)Schematic illustration of nanoparticles administration into a mouse, which was then imaged using a home-built time-resolved upconversion luminescence imaging system. (b)Measured upconversion luminescence decay profiles of PAA-coated core/multishell nanoparticles with lifetimes of τ2, τ5 and τ9(aqueous dispersion). (c)Upconversion luminescence intensity(top left) and lifetime(top right) imaging of PAA-coated core/multishell nanoparticles with lifetimes of τ2 and τ9 in a Kunming mouse and also in a second Kunming mouse(bottom)(subcutaneous injection of these nanoparticles into abdomen). Intravenous administration of PAA-coated core/multishell nanoparticles with a lifetime of τ5 was implemented for the second mouse,enabling us to light up the internal organs for both luminescence intensity(bottom left) and lifetime(bottom right) upconversion imaging. τ values correspond to those of nanoparticles in (b)[24].

5 結論與展望

時間分辨成像技術能利用壽命信號有效地消除自體熒光和光散射,為光學成像提供了新機遇。稀土發光納米材料作為新型熒光探針具有良好的光學性質,如發射峰窄、發光穩定和可調諧的長壽命等,適用于時間分辨成像。 通過稀土納米結構設計已經開發出多種壽命調控策略(核殼結構、濃度、尺寸、熒光共振能量轉移、能量遷移過程)用于開發新型壽命探針。 目前,可調控的長壽命稀土納米發光材料已經應用于高對比度和靈敏度的時間分辨成像(時間門成像和壽命編碼成像),不僅可以實現生物組織成像、微環境監測、疾病標記物檢測和多級防偽,而且還能利用多個壽命信號進行高通量的時域成像,在同一樣品中定量分析多個檢測樣品。 盡管稀土發光納米材料在時間分辨成像中已經取得了一些進展,但在實際應用過程中仍然存在一些挑戰。

(1)量子產率是困擾稀土發光納米材料應用最重要的問題之一[46]。 由于時間門成像的研究中需要采集衰減的熒光信號,稀土納米發光材料的發光亮度會影響其成像效果。 盡管壽命編碼成像與稀土納米發光材料的發光強度無關,但是發光強度會影響壽命信號的采集速度,一般發光越弱采集速度越慢,限制了成像樣品的快速分析。通過提高激發功率可以有效地提升稀土發光納米材料的發光亮度,但是高功率激發會引發熱效應,不利于生物樣品成像。 因此,急需提高稀土發光納米材料的量子效率,以低功率激發實現時間分辨成像。

(2)壽命編碼成像的定量研究。 由于熒光壽命信號與組織深度、激發功率和探針濃度都無關,壽命編碼成像為活體內精確的定量研究提供了新策略[23]。 雖然稀土發光材料與染料的LRET 傳感器能實現體內的定量檢測,但其檢測范圍會受到納米材料尺寸和染料的結合率限制。 因此,基于LFET 的壽命編碼成像還需要構建更加穩定和高效的生物功能交聯方法以提高LRET 配對效率,同時增加響應受體的種類。

(3)時域多通道成像。 利用稀土熒光壽命作為可分辨的時域信號能夠在同一樣品中以最小的體積檢測多種分析樣本,可為生物傳感和臨床疾病診斷提供精確的數據。 高通量的分析需要多種熒光壽命探針與特定的標記物特異性結合,而目前多種標記物的研究模型有限,基于時間分辨技術的多通道成像還有很大的應用潛力。