miRNA-342表達與膀胱癌患者預后的關系分析

郭宗華，孔東波，鄒偉

咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院泌尿外科，湖北 咸寧 437100

膀胱癌是全球第二大常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤，是泌尿生殖系統腫瘤患者的常見死亡原因，在2015年導致約18萬人死亡[1]。研究表明，盡管膀胱癌的5年生存率為77%，但根據膀胱癌的類型和分期而有所不同。當腫瘤為浸潤性但未擴散到膀胱外時，其5年生存率仍為70%，但如果腫瘤細胞遷移到周圍組織（如前哨淋巴結和器官）并擴散到遠處器官，則5年生存率分別下降至35%和＜10%。所以，早期發現沒有近處和遠處轉移的膀胱癌對于提高膀胱癌患者的生存率至關重要[2]。因此，迫切需要鑒定生物標志物以為膀胱癌的早期發現、病情監測提供更多依據。微小RNA（miRNA）是一類內源性表達的約22個核苷酸長的小非編碼RNA，在轉錄后水平負調節基因表達。miRNA參與廣泛的生理過程，包括細胞周期、增殖、轉移、凋亡[3]。最近，越來越多的證據表明，miRNA可以根據其靶miRNA的功能發揮抑癌或致癌的作用[4]。更重要的是，miRNA的異常表達可以作為診斷和預后的生物標志物。在10例年齡、性別和吸煙狀況相匹配的非肌肉浸潤性膀胱癌病例和相應健康對照人群中對血清miRNA進行的高通量篩選中發現，miRNA-342的高表達與膀胱癌發生風險顯著降低有關。在隨后的大樣本研究中，miRNA-342高表達的膀胱癌患者年齡普遍偏低、惡性程度偏高[5]，而在肝癌、多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌中miRNA-342則發揮抑癌作用[6]。這些結果表明，miRNA-342可能在膀胱癌中起作用但其具體意義還需進一步探究。本研究中，檢測了膀胱癌組織和正常膀胱組織之間的miRNA-342表達差異，并評估了miRNA-342表達在膀胱癌患者中的臨床意義及與預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年11月至2014年12月咸寧市中心醫院泌尿外科收治的行根治性全膀胱切除術或膀胱部分切除術的原發性膀胱癌患者的病歷資料。納入標準：經病理學確診為原發性膀胱癌；術前未行放化療，且無其他部位原發性腫瘤。排除標準：不愿或難以配合隨訪；嚴重營養不良及合并心、肝、腎等主要臟器嚴重疾病；患精神疾病。根據納入、排除標準，共納入200例原發性膀胱癌患者，男121例，女79例；年齡54～76歲，平均（63.0±4.9）歲；T1～2期141例，T3～4期59例；單發腫瘤101例，多發腫瘤99例。收集200例患者術后膀胱癌組織和鄰近的正常膀胱組織。將手術切除的所有標本冷凍并保存在液氮中直至后續實驗。

1.2 試劑及實驗儀器

TRIzol?試劑、實時聚合酶鏈反應（realtime polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和逆轉錄試劑均購自日本Takara公司；miRNA-342及內參U6引物設計和合成均由上海吉瑪科技生物有限公司完成。酶標儀、分光光度計和PCR儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集及隨訪 由兩名病理學醫師獨立檢查蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色的組織切片，以確定每個標本的腫瘤分期和組織學分級。所有患者均收集性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數量等臨床資料，其中復發定義為膀胱腔內出現任何新的腫瘤。所有患者獲取完整隨訪資料，包括地址及聯系方式，以門診復查、電話方式對入組患者進行隨訪，隨訪至2019年12月，觀察終點為總生存期（overall survival，OS）：確診膀胱癌至最后因癌癥死亡的時間。

1.3.2 RNA提取及RT-PCR檢測 使用TRIzol?試劑分離組織總RNA，按照說明書進行操作。使用高容量cDNA反轉錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉錄為cDNA。RT-PCR反應是在Bio-Rad CFX96序列檢測系統上使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑進行，以U6作為內部對照，引物序列：miRNA-342正義，5'-AAGATGTGGAAAAATTGGAATC-3'，miRNA-342 反 義 ，5'-ATTCTAATTTCTCCACGTCTTT-3'；U6正 義 ，5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，U6反義，5'-GGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。反應條件為95℃30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s）×40個循環，使用2-△△Ct表示miRNA-342相對表達量，依據miRNA-342相對表達量中位數5.421將患者分為miRNA-342高表達組（n=98）和miRNA-342低表達組（n=102）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Logrank檢驗比較生存情況；影響因素的單因素及多因素分析采用Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌組織及正常膀胱組織中miRNA-342相對表達量的比較

膀胱癌組織中miRNA-342相對表達量為（3.42±0.61），明顯低于正常膀胱組織中的（7.31±1.21），差異有統計學意義（t=28.71，P=0.000）。

2.2 不同臨床特征膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達情況的比較

不同腫瘤分期及是否淋巴結轉移和復發的膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤數量膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.3miRNA-342高表達與低表達膀胱癌患者生存情況的比較

miRNA-342高表達患者中位總生存時間為51.2個月，1年、3年、5年生存率分別為93.8%、79.5%、35.7%，miRNA-342低表達患者中位生存時間為36.1個月，1年、3年、5年生存率分別為78.4%、51.9%、17.6%，miRNA-342高表達患者的生存情況明顯優于miRNA-342低表達患者，差異有統計學意義（χ2=4.549，P=0.003）。（圖1）

2.4 膀胱癌患者預后影響因素的單因素及多因素分析

以Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。單因素分析表明，腫瘤分期、淋巴結轉移、復發和miRNA-342表達與膀胱癌患者預后有關（P＜0.05）（表2）。多因素分析表明，腫瘤分期、淋巴結轉移、復發、miRNA-342表達均是膀胱癌患者預后的獨立影響因素（表3）。

表1 不同臨床特征膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達情況的比較（n=200）

圖1 miRNA-342高表達（n=98）與低表達（n=102）膀胱癌患者的生存曲線

表2 膀胱癌患者預后影響因素的單因素分析

表3 膀胱癌患者預后影響因素的多因素分析

3 討論

作為泌尿系統的常見惡性腫瘤之一，約40%的膀胱癌患者會經歷多次復發，嚴重影響了患者的生活質量。由于目前沒有可靠的診斷性生物標志物可用于早期膀胱癌的檢測，造成了早期發現膀胱癌非常困難。復發與膀胱癌的分期有關，因此迫切需要具有高靈敏度和特異度的新型生物標志物作為膀胱癌的診斷和預后工具[7]。

異常的miRNA表達是癌癥發展過程中的一個常見且重要的特征。越來越多的研究表明，miRNA調節包括膀胱癌在內的各種類型惡性腫瘤中許多與侵襲和轉移相關的基因表達[8]。例如，miRNA-29c可通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA-124-3p過表達顯著抑制了膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力[9]。另一項研究表明，miRNA-155通過抑制腫瘤抑制物周期素D相互作用蛋白1充當膀胱癌的腫瘤啟動子[10]。這些結果表明，miRNA在膀胱癌的進展中起關鍵作用。目前也有研究證明了miRNA作為膀胱癌預后生物標志物的潛在作用。例如，膀胱癌標本中miRNA-148a表達降低，而miRNA-148a表達降低與較短的生存時間有關[11]，miRNA-34a的下調與膀胱癌復發風險降低有關[12]。

在實體腫瘤中，miRNA-342被鑒定為腫瘤抑制因子。例如，miRNA-342通過抑制肺癌中的叉頭蛋白 M1（forkhead box protein M1，FOXM1）抑制肺癌細胞增殖[13]，miRNA-342靶向前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）抑制子宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。Ma等[15]報道miRNA-342通過直接抑制人肺癌中的轉錄因子E2F調節MYC轉錄活性。在肝癌中，miRNA-342通過調節核因子κB途徑影響細胞增殖[16]。在膀胱癌患者血清miRNA高通量篩選中發現，miRNA-342被認為對膀胱癌的發生起到抑制作用，但miRNA-342高表達的膀胱癌患者發生年齡普遍偏低[5]，這一結果說明miRNA-342參與了膀胱癌的發生發展，但miRNA-342是否會影響膀胱癌患者的預后仍不明確。本研究首先檢測了膀胱癌組織和相應正常膀胱組織中miRNA-342的表達，并顯示miRNA-342在膀胱癌組織中表達降低。然后，本研究觀察到miRNA-342表達降低與臨床晚期、復發和有關，這表明miRNA-342表達降低可能促進膀胱癌的侵襲性表型。此外，本研究評估了miRNA-342在膀胱癌預后監測中的作用，發現miRNA-342表達水平較低的患者總生存時間比miRNA-342表達水平較高的患者短，Cox比例風險回歸模型的單因素和多因素分析進一步支持了這些發現，表明miRNA-342是膀胱癌的獨立預后因素。

綜上所述，miRNA-342表達在膀胱癌組織中明顯降低，膀胱癌組織中較低水平的miRNA-342與患者總生存時間縮短有關。miRNA-342是膀胱癌的獨立預后因素，可作為膀胱癌的預后生物標志物。