鹿角方中10 種成分在慢性心力衰竭大鼠左右腎臟中的組織分布

馬靜雅 時瀟麗 劉 力

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院， 上海200021）

鹿角方由鹿角膠、淫羊藿、補骨脂、山茱萸、女貞子、陳皮6 味藥材組成，來源于上海中醫藥大學附屬曙光醫院心內科胡婉英教授［1］。該方是依據“水火既濟，心腎相關” “從腎治心” 的中醫理論，結合多年臨床實踐擬定的治療慢性心力衰竭的補腎強心方，已在臨床上安全使用二十余年，療效確切。

現代藥理和臨床研究表明，鹿角方具有改善心腎功能［2］、抑制心肌肥厚［3］、逆轉心肌纖維化及心室重構［4］等作用。課題組前期建立液質聯用方法同時測定復方鹿角顆粒中18 種氨基酸［5］、13 種成分［6］的含有量，并對其入血成分［7］及心臟組織分布［8］進行了初步分析，但目前尚無關于它在慢性心力衰竭大鼠中腎臟分布的報道。因此，本實驗在前期研究的基礎上采用液相色譜?質譜聯用（LC?MS／MS）法，對鹿角方中10 種成分在慢性心力衰竭大鼠左右腎臟中的組織分布進行分析，以期為該方藥效物質基礎及發揮“從腎治心” 作用的研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Triple?Quad 4500 質譜儀（美國AB SCIEX 公司），含三重四極桿線性離子肼串聯質量分析器、ESI 離子源、Analyst Software 色譜工作站；TG332A 微量分析天平、FA2004 電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；SK7200B 超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；VtexMixer VX200 渦旋混合器（美國Labnet 公司）；LEGEND MICRO 21R 高速離心機（美國Thermo Scientific 公司）；NDK200?2 氮吹儀 （杭州米歐儀器有限公司）；F610 手持組織勻漿機、JXFSTPR?24 自動勻漿機（上海凈信科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 鹿角方浸膏由上海中醫藥大學附屬曙光醫院制劑實驗室制得，每1 g 浸膏粉含5.13 g 生藥。馬錢苷（批號111640?201005）、柚皮苷 （批號 110722?201312）、橙皮苷 （批號110721?201818）、補骨脂素 （批號 110739?200814）、異補骨脂素（批號110738?201715）、淫羊藿苷（批號110737?200415）、寶藿苷Ⅰ（批號113558?15?9） 對照品及瑞格列奈（批號100753?201303） 均購自中國食品藥品檢定研究院。朝藿定A （批號 110623?72?8）、朝藿定 B （批號110623?73?9）、朝藿定C （批號111780?201503）對照品均購自上海同田生物技術股份有限公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，均購自德國CNW公司。

1.3 動物 SPF 級Wistar 雄性大鼠，體質量180～200 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號SYXK （滬） 2014?0008，在18～24 ℃下飼養，自由飲水進食。研究已獲得上海中醫藥大學動物倫理實驗委員會批準。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Phenomenex Luna?C18色譜柱（2.0 mm×100 mm，5 μm）；流動相水（A） ?乙腈（B） ?0.1%甲酸（C），洗針液50%甲醇，梯度洗脫（0～0.1 min，9% B，90% C；0.1～6.0 min，9%～36%B，90%～60% C；6.0～9.0 min，36%～72%B，60%～20% C；9.0～10.0 min，72%～81%B，20%～10%C；10.0～12.0 min，81%B，10%C；12～ 12.01 min，81%～ 9%B，10%～ 90%C；12.01～15.0 min，9%B，90%C ）；體積流量0.8 mL／min；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；進樣量10 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧離子源正離子掃描模式，多反應監測；氣簾氣25 psi （1 psi ＝0.133 kPa）；碰撞氣9 psi，離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓55 V；輔助氣壓55 V；去簇電壓、射入電壓、碰撞能量、碰撞室射出電壓見表1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，各精密吸取適量，50%甲醇稀釋，即得。

2.2.2 內標溶液 精密稱取瑞格列奈適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密吸取適量，50%甲醇稀釋，即得（50 ng／mL）。

2.2.3 標準曲線樣品溶液 取300 μL 空白腎組織勻漿液，精密加入對照品、內標溶液各10 μL 后進行預處理，即得（馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素、寶藿苷Ⅰ質量濃度分別為0.072～72、0.144～144、0.096～96、0.072～72、0.072～72、0.072～72、0.036～36、0.481～481、0.572～572、0.024～24 ng／mL）。同法制備質量控制樣品溶液。

表1 質譜選擇器通道及相關參數Tab.1 MS selector channels and relative parameters

2.3 樣品預處理 采用乙腈沉淀蛋白法。精密吸取300 μL 空白腎組織勻漿液，精密加入10 μL 內標溶液，渦旋混勻1 min 后精密加入4 倍量乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，取上清液，常溫下氮氣吹干，濃縮后精密加入150 μL 50% 甲醇復溶，渦旋振蕩2 min，4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，吸取上清液進行LC?MS／MS分析。

2.4 慢性心力衰竭大鼠模型建立 參考文獻［9］，大鼠術前禁食，腹腔注射4%水合氯醛麻醉后仰臥位固定，于劍突下0.5 cm 處沿腹白線依次打開腹腔，用已浸潤過生理鹽水的棉球撥開腸道，在左腎上緣鈍性分開后腹膜等軟組織，暴露腹主動脈，在雙側腎動脈之間分離腹主動脈，用4?0 號真絲編織線將腹主動脈與6 號鈍頭不銹鋼針結扎，待線扎緊后取出不銹鋼針，結扎處明顯窄縮時依次縫合肌層、皮膚；假手術組大鼠開腹、暴露主動脈后不結扎，其余操作步驟同模型組。術后大鼠保溫，肌肉注射青霉素，連續3 d，每天1 次。

2.5 給藥方案及腎組織采集 建模后，將存活的大鼠隨機分為假手術組、模型組及鹿角方低劑量組（0.16 g／mL）、中劑量組（0.31 g／mL）、高劑量組（0.63 g／mL）（分別取鹿角方浸膏粉8、15.5、31.5 g 于離心管中，加水定容至50 mL），假手術組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水，鹿角方各劑量組大鼠灌胃給予相應藥物混懸液，各組給藥劑量均為7 mL／kg，每天1 次，連續30 周。根據前期預實驗結果，本實驗在末次灌胃給藥后2 h 麻醉大鼠，腹主動脈取血，置于離心管中，迅速取出左右腎臟，生理鹽水清洗殘留血液，加入4 倍量蒸餾水勻漿，-80 ℃下保存。

2.6 統計學分析 計量資料以（） 表示，組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統計學意義。采用線性擬合方法，分析各成分含有量與給藥劑量的關系。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性、靈敏度試驗 本實驗比較了6 批空白大鼠腎組織勻漿樣品、質量濃度定量下限腎組織勻漿樣品、給藥后2 h 腎組織勻漿樣品的色譜圖，發現勻漿液中內源物質在相應出峰時間不干擾樣品測定，同時以信噪比（S／N） ≥10 時的質量濃度為定量下限，各成分峰形理想，表明該方法專屬性、靈敏度良好，見圖1。

2.7.2 線性關系考察 按“2.2.3” 項下方法制備標準曲線樣品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），各成分與內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.7.3 精密度、準確度試驗 按“2.2.3” 項下方法制備質量控制樣品溶液，按“2.3” 項下方法預處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，同一天內進行6 次，計算日內精密度；連續測定3 d，每天1 次，計算日間精密度，結果見表3，可知該方法精密度、準確度良好。

2.7.4 回收率、基質效應試驗 按“2.2.3” 項下方法制備質量控制樣品溶液，每個質量濃度平行6 份，按“2.3” 項下方法預處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，記錄各成分、內標峰面積；取空白腎組織勻漿液，按“2.3” 項下方法預處理（至“常溫下氮氣吹干” 為止），加入相應質量濃度對照品、內標溶液各10 μL，再精密加入130 μL 50%甲醇復溶，渦旋振蕩3 min，4 ℃下10 000 r／min離心5 min，取10 μL 上清液進行分析；平行配制相同質量濃度的標準曲線樣品溶液，按“2.3” 項下方法預處理，每個質量濃度平行6 份，結果見表4，可知該方法基質效應良好。

圖1 各成分LC?MS／MS 色譜圖Fig.1 LC?MS／MS chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關系Tab.2 Liner relationships of various constituents

2.7.5 穩定性試驗 按“2.2.3” 項下方法制備質量控制樣品溶液，每個質量濃度平行6 份，分別考察其在室溫下放置6 h，4 ℃下自動進樣器中放置24、48 h，反復凍融3 次后的穩定性，結果見表5，可知該方法穩定性良好。

2.8 腎組織分布 表6 顯示，同一劑量組內各成分在大鼠左右腎臟中的含有量無明顯差異（P＞0.05），但除了鹿角方中劑量組寶藿苷Ⅰ外，各組其他9 種成分在左腎中的含有量低于右腎中，以柚皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷、補骨脂素更明顯。再對各成分含有量與給藥劑量的關系進行擬合，結果見表7，可知其含有量均隨著給藥劑量增加而升高。另外，很難測定鹿角方低劑量組朝藿定A 含有量，而且橙皮苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C 含有量也相對較低。

3 討論與結論

中醫認為，心屬火藏神，腎屬水藏精，水火既濟是指以上兩臟互相作用、互相制約以維持正常的生理活動［10］。慢性心力衰竭病機為心氣虛，漸至氣虛及陽，日久及腎，以致心腎陽虛，瘀水內停，屬心腎同病之證，這可為鹿角方以“溫腎求強心”“從腎治心” 理論治療該疾病提供依據。

表3 各成分精密度、準確度試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of precision and accuracy tests for various constituents （n＝6）

表4 各成分回收率、基質效應試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery and matrix effect tests for various constituents （n＝6）

表5 各成分穩定性試驗結果（n＝6）Tab.5 Results of stability tests for various constituents （n＝6）

表6 各成分在大鼠左右腎臟中的組織分布（ng／g，， n＝4～6）Tab.6 Tissue distribution of various constituents in the left and right kidneys of rats （ng／g，， n＝4-6）

表6 各成分在大鼠左右腎臟中的組織分布（ng／g，， n＝4～6）Tab.6 Tissue distribution of various constituents in the left and right kidneys of rats （ng／g，， n＝4-6）

注：—表示該成分含有量低于定量下限，無法測定。

本實驗采用腹主動脈縮窄方法，建立慢性心力衰竭大鼠模型。腹主動脈縮窄部分位于左腎腎動脈與右腎腎動脈之間，而左腎位于縮窄處的下方，與右腎相比其縮窄造成的血流量明顯減少，并且質量更小，同時有一部分出現萎縮。因此，血供減少可能是導致鹿角方中馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素含有量在大鼠左腎中偏低的主要原因。

表7 各成分含有量與給藥劑量的關系Tab.7 Relationships between the contents of various constituents and administration doses

淫羊藿苷［11］、朝藿定C［12］、馬錢苷［13］、橙皮苷［14］、柚皮苷［15］等化合物均可改善腎臟損傷，本實驗對上述入血成分在慢性心力衰竭大鼠腎組織中的含有量進行分析，發現均能檢測出，可能是鹿角方改善腎功能的藥效物質基礎。灌胃2 h 后發現，補骨脂素、異補骨脂素、馬錢苷含有量較高，而其他含有量較低的成分為黃酮。研究表明，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 在體內可轉換成次級苷，后者滲透性好，更有利于吸收入血［16］，其代謝成分有待進一步考察。

綜上所述，本實驗首次研究鹿角方在慢性心力衰竭大鼠左右腎臟中的組織分布，建立LC?MS／MS法對方中10 種活性成分（補骨脂素、異補骨脂素、馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ） 進行定量分析，并進行方法學、腎組織分布考察。這有助于進一步研究鹿角方治療慢性心力衰竭的藥效物質基礎，也為研究該方發揮“心腎相交” “從腎治心”作用的機制提供借鑒。