黃連膏提取工藝優化及其體外抗炎活性

王遠茜 韓 冰 王 丹 王思明 李 娜* 趙大慶*

（1.長春中醫藥大學， 吉林長春130117； 2.長春金賽藥業股份有限公司， 吉林長春130012）

黃連膏出自清代吳謙的《醫宗金鑒》，是用于治療皮膚創面疾病的中醫經典名方，原配方為當歸尾五錢、黃連三錢、黃柏三錢、生地一兩、姜黃三錢，按照清代度量衡制度結合2015 年版《中國藥典》 計量單位，將其換算為黃連11.175 g、當歸尾18.625 g、生地黃37.250 g、黃柏11.175 g、姜黃11.175 g，總生藥量89.4 g。方中姜黃破血行氣，當歸活血養血，生地清熱生津、涼血養陰潤燥，黃連清熱燥濕，黃柏瀉火解毒［1］，攻效清熱癤腫、清熱解毒、潰瘍創傷，主要用于治療肺經壅熱、上攻鼻竅，致生鼻瘡、干燥腫疼等，對皮膚濕疹、水火燙傷、紅腫熱瘡、乳頭碎痛也有理想療效。近年來，該方在治療新生兒紅臀、痔瘡、燒燙傷、壓瘡、粉刺等也呈現了良好作用，堪稱中醫外科之“圣藥”［2?3］。

黃連膏以清利濕熱為組方原則，對濕疹的治療有著悠久歷史［4］。濕疹是由多種因素引起真皮淺層、表皮炎癥的皮膚病，目前市面上常用藥物以西藥為主，但大多含有激素類成分，具有較大的不良反應；中藥膏劑治療濕疹具有不良反應小、療效好、不易復發的優勢，可通過皮膚涂抹使藥物直達病所，不僅能透達腠理來發揮局部治療作用，還可經過肌膚、毛竅而深入臟腑，從而起到內外合治的目的［5?6］。本實驗將優化黃連膏提取工藝，并選擇人永生化角質形成細胞（HaCat 細胞） 作為對象對該方體外抗炎作用進行研究，以期為今后相關機制的考察提供依據。

1 材料

1.1 儀器 細胞培養箱（美國Thermo 公司，型號3131）；酶標儀 （瑞士Tecan 公司，型號infinite M200 PRO）；電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司，型號AL204）；粉碎機（北京錕捷玉誠機械設備有限公司，型號GS?05）；高效液相色譜儀 （美國Agilent 公司，型號1100）。

1.2 試劑與藥物 姜黃、當歸、生地、黃連、黃柏均購自宏檢大藥房，經長春中醫藥大學中藥鑒定學教研室王哲副教授鑒定為正品。香油 （燕莊牌）。MEM 培養基 （美國HyClone 公司，貨號SH30022.01）；胎牛血清 （貨號04?002?1ACS）、1%雙抗（貨號03?031?1B）（美國BI 公司）；0.25%胰 酶?EDTA （美 國 MRC 公 司，貨 號CC830031.02）；MTT 試劑盒（北京Solarbio 公司，貨號M8180）；反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號PR047A）；TRIzol （美國羅氏公司，貨號11667165001）；人腫瘤壞死因子?α （TNF?α）、人干擾素?γ （IFN?γ） 細胞因子（美國Biolegend 公司，貨號300?01A?10、300?02?20）；胸腺活化調節趨化因子 （TARC）、巨噬細胞源性趨化因子（MDC）、調節活化T 細胞表達和分泌因子（RAN?TES）、白細胞介素?8 （IL?8） ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，貨號 BPE10052、BPE10132、BPE10120、BPE10139）。

1.3 細胞株 人正常表皮永生化角質形成細胞系HaCat 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 姜黃素總量測定 姜黃為黃連膏君藥，其藥理作用廣泛，無毒，耐受性好，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用［7］，主要有效成分為姜黃素，在治療炎癥介導的疾病中有著重要地位，并且《中國藥典》 相關檢測方法實用性強，易于操作。因此，本實驗選擇姜黃素作為指標成分［8］。

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-4% 冰醋酸 （48 ∶52）；體積流量1 mL／min；檢測波長430 nm；進樣量5 μL。理論塔板數按姜黃素峰計算，應不低于4 000［9］。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取姜黃素對照品1.20 mg，甲醇制成每1 mL 含12 μg 該成分的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 甲醇，稱定質量，75 ℃水浴加熱回流提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以姜黃素進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝3 509.2X-3.293 3 （r＝0.999 8），在0.036～0.216 μg 范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，每次5 μL，測得姜黃素峰面積RSD 為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，每次5 μL，測得姜黃素峰面積RSD 為0.72%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批黃連膏提取油6 份，每份5.0 g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，各吸取5 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得姜黃素總量RSD 為1.28%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，共6 份，精密加入等量對照品溶液，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得姜黃素平均加樣回收率為99.1%，RSD 為0.51%。

2.2 提取工藝優化 依據《醫宗金鑒》 提取工藝，取香油十二兩（即加入5 倍量香油，每個處方447 g），將藥“煠枯” 后撈去渣，選擇藥材粒度、煎炸時間、煎炸溫度、浸泡時間作為影響因素，姜黃素總量作為評價指標，在前期單因素試驗基礎上采用正交試驗優化工藝［10］。因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

方差分析見表3，可知因素B、C對提取有顯著影響 （P＜0.05），而因素A、D無顯著影響（P＞0.05）；各因素影響程度依次為B＞C＞A＞D，故確定D作為誤差項。由表2 可知，最優工藝為A1B2C2D2，為了節省成本，縮短生產周期，最終確定為A1B2C2D1，即飲片不浸泡而直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

再進行3 批驗證試驗。按處方取10 倍量飲片，共3 份，按上述優化工藝提取，撈出炸枯的藥渣，濾過，測定提取油質量和姜黃素總量，結果見表4，可知工藝穩定可靠。

表4 驗證試驗結果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests （n＝3）

2.3 體外抗炎活性研究

2.3.1 細胞培養及模型建立 采用含1% 雙抗、15%胎牛血清的MEM／EBSS 液體培養基，將HaCat細胞置于25 cm2培養瓶中，在飽和濕度培養箱（37 ℃、5%CO2） 中培養，24 h 后更換培養液，除去未貼壁細胞，每隔1～2 d 更換1 次培養液至細胞生長融合，待細胞貼壁達到70%～80% 時，用0.25%EDTA?胰蛋白酶消化液消化細胞，并進行傳代［11］。

由于血清可誘導細胞因子的分泌，從而影響體外濕疹模型的建立，故采用血清饑餓法建立體外濕疹炎癥模型［12］。取對數生長期的HaCat 細胞，按每孔4 000 個細胞量均勻接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后換無血清空白培養基饑餓細胞6 h，再更換含有不同造模濃度細胞因子的培養基中培養24 h。設置空白培養基組、10 ng／mL TNF?α ＋10 ng／mL IFN?γ 組、20 ng／mL TNF?α ＋20 ng／mL IFN?γ 組、30 ng／mL TNF?α ＋30 ng／mL IFN?γ 組、40 ng／mL TNF?α ＋40 ng／mL IFN?γ 組，每組設6 個副孔，培養結束后加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，置于37 ℃培養箱中培養4 h 后吸去培養基，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀在490 nm 波長處檢測光密度（OD），計算細胞存活率，公式為存活率＝OD藥物／OD空白×100%，篩選LD50時的造模濃度［13］。

采用重復測量設計的方差分析，發現不同造模濃度TNF?α、IFN?γ 對HaCat 細胞存活率影響的差異有統計學意義（P＜0.05），并隨著造模濃度升高而逐漸降低（P＜0.05）。圖1 顯示，當造模濃度為20 ng／mL 時，細胞存活率為50%，即為LD50。

圖1 造模濃度對HaCat 細胞存活率的影響Fig.1 Effect of modeling concentration on the survival rate of HaCat Cells

2.3.2 細胞毒性試驗 0.25% EDTA?胰蛋白酶消化HaCat 細胞后，MEM 完全培養基吹打稀釋成濃度為4×104／mL 的細胞懸液，以每孔100 μL 的體積加到96 孔板中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。細胞貼壁后棄去完全培養基，加入空白培養基饑餓培養6 h，再加入含0.05、0.5、1、2 μL／mL黃連膏提取油的MEM 空白培養基各100 μL，以MEM 空白培養基為空白對照組［14］，每組平行設置6 個副孔，作用24 h 后每孔加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，繼續培養4 h，棄去原培養液，加入150 μL DMSO 溶解，振蕩3 min 使結晶物充分溶解，在490 nm 波長處檢測吸光度（OD），計算細胞存活率，結果見圖2。由此可知，提取油濃度為2 μL／mL 時對細胞生長有抑制作用（P＜0.01），存活率為77%，而在0.05～1 μL／mL時無細胞毒性，故最終選擇0.05、0.5、1 μL／mL作為實驗濃度。

圖2 黃連膏提取油對HaCat 細胞存活率的影響Fig.2 Effect of Huanglian Ointment extract oils on the survival rate of HaCat cells

2.3.3 TARC、MDC、RANTES、IL?8 水平檢測 取對數生長期的HaCat 細胞，接種于6 孔板中（每孔7×104個） 培養24 h，待細胞貼壁后更換無血清培養基饑餓細胞4 h，棄去空白培養基，以MEM 空白培養基為空白對照組，加入含“2.3.1”項造模濃度TNF?α、IFN?γ 及0.05、0.5、1 μL／mL黃連膏提取油的無血清培養基，處理細胞24 h，收集每孔上清培養基，1 000 r／min 離心5 min 以去除細胞碎片，ELISA 法檢測上清培養基中TARC、MDC、RANTES、IL?8 水平［15］。圖3 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理HaCat 細胞后TARC 水平高于空白對照組（P＜0.05），而黃連膏提取油對其水平有較強的抑制作用，并呈劑量依賴性（P＜0.01）。

圖3 黃連膏提取油對TARC 水平的影響Fig.3 Effect of Huanglian Ointment extract oils on TARC level

圖4 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理HaCat 細胞后MDC 水平高于空白對照組（P＜0.05），而黃連膏提取油對其水平有較強的抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01），以1 μL／mL 更明顯。

圖4 黃連膏提取油對MDC 水平的影響Fig.4 Effect of Huanglian Ointment extract oils on MDC level

圖5 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理后RANTES 水平高于空白對照組（P＜0.05），而1 μL／mL 黃連膏提取油對其水平有較強的抑制作用（P＜0.01）。

圖5 黃連膏提取油對RANTES 水平的影響Fig.5 Effect of Huanglian Ointment extract oils on RANTES level

圖6 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理后IL?8 水平高于空白對照組 （P＜0.05），而 0.05、0.5、1 μL／mL黃連膏提取油對其水平有較強的抑制作用（P＜0.01）。

圖6 黃連膏提取油對IL?8 水平的影響Fig.6 Effect of Huanglian Ointment extract oils on IL?8 level

3 討論

傳統上，皮質類固醇（軟膏、乳膏或注射劑）被認為是治療濕疹最有效的方法［16］，但其長期應用會引起不良反應，導致臨床上受到限制［17?18］，故迫切需要開發相關新型藥物。濕疹發病機制與角質形成細胞作用的失調有關，促炎細胞因子對后者的刺激可引起炎性趨化因子產生，可專門用于招募效應細胞（如單核細胞、粒細胞、T 淋巴細胞），從而促進皮損炎癥反應的發展［19?20］。

本實驗采用正交試驗對黃連膏提取工藝進行優化，發現各因素對姜黃素總量的影響程度依次為煎炸時間＞煎炸溫度＞藥材粒度＞浸泡時間，其中煎炸時間、煎炸溫度更顯著；由直觀分析結果可知，最優提取工藝為將藥材飲片直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。驗證試驗顯示，該工藝準確度高，穩定可行，具有實際利用價值，可使古方工藝中的“將藥煠枯” 操作標準化，為經典名方黃連膏的新劑型開發打下堅實基礎。

體外抗炎活性實驗結果表明，炎性趨化因子TARC、MDC 水平隨著黃連膏提取油濃度升高而降低，并呈現劑量依賴性，同時高濃度（1 μL／mL）下IL?8、RANTES 水平基本恢復正常。由此可知，黃連膏可明顯抑制炎癥介質釋放，減輕表皮細胞炎癥反應，促進皮膚屏障恢復［21］。