車前子對原發性高血壓大鼠的降壓作用

蘭繼平 張潔玉 童仁超李 娜李 緯李亞娟王崢濤楊 莉*

（1.上海中醫藥大學中藥研究所， 中藥標準化教育部重點實驗室， 上海201203； 2.上海中醫藥大學交叉科學研究院， 上海201203）

高血壓（Hypertension） 是最常見的心血管疾病之一，它是以體循環動脈壓增高為主要表現，可伴有心、腦、腎等器官功能或器質性損害的臨床綜合征，可導致腦卒中、冠心病等，在臨床上有高致殘率和高致死率的特點［1?2］。隨著社會工作頻率和生活節奏的加快，高血壓的發病率已在逐年上升。據報道，目前我國18 歲及以上成人高血壓患病率為25.2%［3］。目前臨床上用于治療高血壓的藥物有很多種，但都存在著局限性，長期服藥甚至有著明顯的不良反應［4］。而中藥因其成分的多樣性而具有的多環節、多途徑、多靶點的作用特點在治療高血壓方面受到越來越多人的關注［5］。

車前子為車前科車前屬植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子，有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰等功效?，F代研究表明車前子具有治療高血壓、糖尿病和機體脂質紊亂的作用［6］。本實驗以車前子為研究對象，以原發性高血壓大鼠（Spontaneous Hy?pertension Rat，SHR） 為模型，探討車前子對SHR高血壓的作用，通過對腎素?血管緊張素?醛固酮系統（Renin?Angiotensin?Aldosterone System，RAAS）和血管相關功能的研究，探討其可能的降血壓途徑。

1 材料

1.1 藥物與試劑 車前子藥材 （批號1212030642，產地江西） 購自上海康橋藥業有限公司，由上海中醫藥大學中藥所吳立宏副研究員鑒定為正品。福辛普利鈉片（國藥準字H20023371）購自中美上海施貴寶制藥有限公司生產；氯化鎂（批號20140821）、碳酸氫鈉（批號201401201）、氯化鈣 （批號 201201025）、葡萄糖 （批號20160322）、95%乙醇，購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；水為自制蒸餾水。苯腎上腺素（Phe?nylephrine，PE，批號P6126）、乙酰膽堿（Acetyl?choline，ACH，批號A6625）、硝普鈉（Sodium ni?troprusside，SNP，批號 SN?60Q91） 購自美國Sigma 公司。腎素（Renin，批號EL160617）、血管緊張素Ⅱ （Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ，批號EL161117）、血管緊張素轉化酶（Angiotensin con?verting enzyme，ACE，批號EL170218）、醛固酮（Aldosterone，ALD，批號EL170618） 酶聯免疫試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；內皮素?1（Endothelin?1，ET?1，批號SBJ?R0140）、內皮型一氧化氮合酶 （Endothelial nitric oxide synthase，eNOS，批號SBJ?T0017） 酶聯免疫試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 儀器 ALC?NIBP 大鼠無創血壓測量分析系統（上海奧爾科特生物科技有限公司）；BH2 型光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；ML740 型PowerLab／4SP 生物信號處理和分析系統（澳大利亞ADInstruments 公司）；恒溫平滑肌浴槽為上海中醫藥大學中藥研究所自制；744 型PH 計［瑞士Metrohm （萬通） 公司］；RH?KT／C 型磁力攪拌器［廣州愛卡儀器設備（IKA） 公司］。

1.3 動物 8～12 周齡清潔級雄性SHR 和Wistar?Kyoto （WKY） 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK （京）2016?006，飼養于上海南方模式生物中心清潔級屏障動物房標準鼠籠，動物進食進水不限，光照周期12 h／12 h，室溫22～23 ℃，相對濕度45%～50%。相關動物實驗過程符合動物倫理委員會的要求。

2 方法

2.1 藥物制備 取車前子適量，加入10 倍量95%乙醇，熱回流提取2 h，提取3 次，合并提取液，50 ℃減壓回收溶劑，冷凍干燥得到車前子干燥浸膏。4 ℃密封保存，臨用時取適量浸膏制成0.13 g 生藥／mL溶液。陽性藥溶液，取福辛普利鈉片2 粒（含福辛普利鈉，10 mg／片），研碎，溶于40 mL 蒸餾水中，得到質量濃度為0.5 mg／mL 福辛普利鈉溶液。

2.2 配置Krebs?Henseleit （K?H） 溶液 在磁力攪拌器下，2 L 雙蒸水中依次加入氯化鈉13.792 g、氯化鉀0.701 g、氯化鈣0.566 g、硫酸鎂0.284 g、磷酸二氫鉀0.321 g、碳酸氫鈉4.180 g、葡萄糖4.399 g （為避免形成難溶物使溶液渾濁，應在上1個化合物完全溶解后再加下1 個化合物），充分攪拌溶解后，用稀鹽酸調節pH 至7.40 左右，即得。

2.3 配置氯化鉀溶液 在磁力攪拌下，在1 L 水中分別加入氯化鈉36.64 g、氯化鉀44.73 g、磷酸二氫鉀1.632 g、碳酸氫鈉21.004 g、充分溶解得到高濃度氯化鉀母液。取高濃度氯化鉀母液50 mL，氯化鈣0.184 g，氯化鎂0.122 g，葡萄糖1.0 g，加入到450 mL 純水中充分溶解搖勻，調節pH 到7.4，即得。

2.4 分組 選用8～12 周齡雄性SHR 24 只和WKY 大鼠8 只，適應性喂養7 d。利用大鼠無創血壓儀測量每只SHR 血壓，將SHR 隨機分為模型組、陽性藥組（2.5 mg／kg）、車前子組（1.3 g 生藥／kg），WKY 大鼠作為正常組，每組8 只。各組大鼠按5 mL／kg 灌胃給藥，每日1 次，連續8 周，其中正常組和模型組給予相同體積蒸餾水。每2 周采用ALC?NIBP 大鼠無創血壓測量分析系統測定各組大鼠尾動脈壓。動物禁食不禁水8 h，腹腔注射20%烏拉坦麻醉（7 mL／kg），腹主動脈收集血液，迅速分離主動脈弓下約1 cm 處長約1.2 cm 的胸主動脈，置于K?H 液平皿中，待做后續處理。

2.5 動脈血管環舒縮功能測定 大鼠離體動脈血管環的制備，將置于4 ℃預冷、預氧飽和的K?H液中的動脈條，在顯微鏡下小心清除血管表面多余組織后，每根動脈剪約3 mm 長的血管環2 根，將血管環置于盛有37 ℃恒溫K?H 液（4 mL） 中，并持續通入95%氧氣、5%二氧化碳的混合氣體的麥氏浴槽中，每個血管環用2 個L 型不銹鋼小鉤小心貫穿入血管環的腔管，一段固定在浴槽底端，另一端通過絲線連接張力換能器，張立的變化傳輸并計入在PowerLab／4SP 生物信號記錄分析系統。

動脈血管環張力的測定，制備好的血管環固定在浴槽，給予2 g 張力（靜息張力） 并穩定平衡60 min，每20 min 換1 次K?H 液。血管環張力穩定之后，棄去K?H 液，加入已在37 ℃預熱的氯化鉀溶液，20 min 達到穩定之后，記錄數據，棄去氯化鉀溶液，重新換上37 ℃預熱的K?H 液，血管舒張達到穩定之后再次換上37 ℃預熱的氯化鉀溶液，血管收縮達到穩定之后計入數據，再次換上37 ℃預熱的K?H 液。穩定之后，以累計濃度的PE （1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于動脈血管環上，每個濃度作用至平衡，大約時間為5 min，以最后1 次K?H 液的穩定值為基準值，記錄加入PE 穩定時的數據。后棄去浴槽內液體，用K?H 也重新平衡3 次，20 min／次。最后一次平衡之后，加入10-6mol／L 濃度的PE 刺激血管環，使血管收縮達到最大幅度，再先后給予累計濃度的ACH （1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于動脈血管環，引起血管舒張，每個濃度作用5 min。最后穩定在最后1 個ACH 濃度時加入10 μL SNP，平衡時記錄數據。

以血管環在10-6mol／L 濃度PE 達到的最大收縮幅度和加入SNP 穩定的舒張幅度之間的差值作為100%，將各濃度ACH 引起的舒張反應與最大收縮幅度比較，計算出各自的舒張百分值，繪制量?效曲線。本實驗在上海中醫藥大學穆拉德中心實驗室完成。

2.6 檢測生化指標 按酶聯免疫試劑盒所述方法分別測定并計算血清中Renin、ALD、ACE、AngⅡ、eNOS 和ET?1 的水平。

2.7 統計學分析 應用GraphPad Prism 7 軟件進行統計，數據以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較比較采用t檢驗。以P≤0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 車前子對SHR 血壓的影響 如表1 所示，除正常組外，模型組和各給藥組大鼠在給藥前血壓均大于160 mmHg；給藥2 周后，模型組血壓上升至（184.59±3.16） mmHg，與模型組比較，車前子組血壓下降（P＜0.001）；連續給藥8 周后，車前子組與模型組（187.83±1.15） mmHg 相比下降幅度達到20 mmHg 左右（P＜0.01）。提示長期服用車前子可維持收縮壓在較低的水平。

表1 各組給藥8 周大鼠收縮壓（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

表1 各組給藥8 周大鼠收縮壓（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 血清中RAAS 相關指標測定 如圖1 所示，與正常組比較，模型組中調控血壓升高相關指標ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平增加（P＜0.01）。給藥8 周后，與模型組比較，車前子組中大鼠血清ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。表明車前子可通過調控RAAS 的紊亂，進而達到調控血壓的目的。

圖1 各組大鼠RAAS 的水平（n＝8）Fig.1 Levels of RAAS in each group （n＝8）

3.3 PE 作用于胸主動脈血管環收縮率 SHR 胸主動脈血管環收縮率比較，模型組收縮率在PE 濃度為1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L 時與正常組比較分別增強了438.0%、68.4%、32.6%和33.0%，均差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），表明模型組SHR 的胸主動脈的收縮明顯增強。與模型組比較，車前子組在PE 濃度為1×10-6、1×10-5mol／L 收縮率分別減小了17.8%、18.1% （P＜0.01），表明車前子對這幾個濃度PE引起的血管收縮上有抑制作用（P＜0.01）。結果見表2、圖2。

表2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環收縮率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

表2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環收縮率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

圖2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環收縮率曲線（n＝8）Fig.2 Vascular ring contraction rate curves of rats in each group at different PE concen?trations （n＝8）

3.4 ACH 作用于胸主動脈血管環舒張率 與正常組比較，模型組胸主動脈血管環在1×10-8～1×10-5mol／L ACH 作用下，舒張率下降 （P＜0.05，P＜0.01），表明高血壓大鼠血管的舒張受到明顯的抑制。給藥之后，與模型組比較，車前子組胸主動脈血管環在1×10-8、1×10-7、1×10-6mol／L ACH 作用下舒張率升高（P＜0.05），表明車前子能顯著性的改善ACH 誘導的高血壓大鼠血管舒張受抑制的情況。結果見表3、圖3。

3.5 血清中eNOS 和ET?1 水平的測定 如圖4 所示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠中eNOS 和ET?1 的水平分別上升了17.1%、24.0%，均差異有統計學意義（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，車前子組中模型大鼠血清中的eNOS、ET?1 水平分別降低了11.1%、30.5%，均差異有統計學意義（P＜0.05）。表明車前子可抑制SHR 中高表達eNOS、ET?1 水平，這可能是車前子能降低血壓的途徑之一。

表3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環舒張率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

表3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環舒張率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環舒張率曲線（n＝8）Fig.3 Vascular ring relaxation rate curves of rats in each group at different ACH concentrations （n＝8）

4 討論

圖4 給藥后各組大鼠內皮相關功能指標水平（n＝8）Fig.4 Levels of endothelial?related function indexes after administration （n＝8）

RAAS 不僅在心血管系統的發育、血壓和血容量的調節、以及心血管系統結構與功能的重塑方面起著重要作用，還與水鹽代謝有著密切的聯系，在人類高血壓形成中起著至關重要的作用［7］。腎素是由腎小球細胞合成和分泌的一種酸性蛋白酶，通過腎靜脈進入血液循環后，刺激使血中由肝生成的血管緊張素原（屬α 球蛋白） 產生血管緊張素Ⅰ（AngI，10 肽），而Ang 在ACE 作用下變成AngⅡ（10 肽）［8］。AngⅡ是已知最強的縮血管活性物質之一，可作用于血管平滑肌，使全身微動脈收縮，動脈血壓增高，另外AngⅡ促進ALD 的分泌，激活RAAS，引起血壓升高［9］。AngⅡ不僅具有調節血管的收縮作用，并且和氧化應激和炎癥因子息息相關［10］。在本實驗中，車前子能顯著降低SHR Renin、ACE、AngⅡ和ALD 的水平，從而達到降壓的目的。

血管腔的大小由血管平滑肌的收縮狀態決定，所以血管平滑肌的緊張程度異常增大參與了血管性疾病的發生機制［11］。其中Ca2＋和血管內皮細胞釋放的一系列，如NO、前列腺素、超極化因子，作為關鍵性因子影響著血管平滑肌的舒縮。其中Ca2＋的影響主要源于它的內流和外流。Ca2＋的內流主要通過平滑肌細胞的電壓依賴性Ca2＋通道和受體操縱性Ca2＋通道來完成的［12］。本實驗結果顯示，給予藥物車前子之后，胸主動脈在PE 的刺激下的收縮明顯得到了抑制，在ACH 的刺激下的舒張有明顯的促進作用。結果表明車前子對于高血壓大鼠的血管舒縮功能有著改善作用，這可能是車前子降血壓作用的重要途徑之一。

另外，血管內皮功能障礙在高血壓的發病及其所致的慢性并發癥中起重要作用。NO 和ET?1 之間復雜的相互作用可以促使血管內皮功能障礙的發生。ET?1 與血壓水平呈正相關外，與靶器官損害程度呈平行關系，因此，ET?1 在高血壓病及其并發癥的診斷和療效判定上有重大的意義。NO 是內皮細胞產生的具有可擴散性、擴張血管的一種物質，內皮細胞釋放的NO 在生理狀態下可使內皮下血管平滑肌細胞處于增殖靜止狀態從而達到抗血管壁增殖的作用［13?14］，因此對于血壓的調控同樣起著重要的作用。而給予藥物車前子之后，模型大鼠中ET?1 和eNOS 的水平顯著降低，表明調節內皮細胞功能亦是車前子降血壓的重要途徑之一。

綜上所述，車前子對SHR 有著良好的降低血壓作用，其對SHR RAAS 中紊亂Renin、ACE、AngⅡ、ALD 水平，血管舒張和收縮功能障礙以及血管內皮相關功能ET?1 和eNOS 紊亂的改善作用可能是降低血壓的重要途徑。