安胰顆粒對SAP 大鼠胰腺組織NF?κB、iNOS、COX?2 表達的影響

文 玲 邊志遠 廖健思 尹胡海 田玉玲 雷力民*

（1.廣西中醫藥大學， 廣西南寧530001； 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院， 廣西南寧530011）

重癥急性胰腺炎 （severe acute pancreatitis，SAP） 是臨床內科診療疾病中常見的需要長期治療及有著高死亡率的急危重癥，總體病死率高達20%～30%［1］。起病早期可發生全身炎癥反應綜合征 （systemic inflammatory response syndrome，SIRS），隨后導致多器官功能障礙綜合征（multiple organ syndrome，MODS）［2］。研究表明SAP 發病機制與細胞因子存在強相關性，細胞因子不僅參與炎癥反應，同時可激活胰腺組織信號通路而參與胰腺微循環改變過程。核因子?κB （nuclear factor?κB，NF?κB） 作為首動因子與多種細胞因子具有上下游關系。當NF?κB 被不適當激活而異常增高時，一方面引起腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素（interleukin，IL） 等炎癥因子基因轉錄后大量表達［3］，引發SIRS；另一方面通過一系列聯級反應放大刺激誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環氧合酶?2（cyclo?oxygenase，COX?2） 等血管微循環相關因子快速表達而發生胰腺微循環障礙導致MODS 走向死亡。本研究從核因子層面出發，探討NF?κB／iNOS?COX?2 信號通路對SAP 時胰腺微循環的影響及安胰顆粒治療SAP 的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性健康SD 大鼠120 只，體質量200～250 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心［動物生產許可證號SCXK （桂） 2017?0002］。

1.2 藥物和試劑 安胰顆粒［4］由大承氣湯化裁，主要含有生大黃、玄明粉、甘遂、紅藤、莪術等，由廣西中醫藥大學監制，江陰天江藥業有限公司調配顆粒制劑 （批號1207303）；白介素?10 （rh IL?10，美國 PeproTech 公司）；左旋精氨酸（L?arginine，北京索萊寶科技有限公司）；EDTA（pH＝9.0） 抗原修復液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1203）；TRIzol 試劑（美國Thermo Fisher 公司，貨號15596?026）；RNase 抑制劑（美國ABI 公司，貨號N8080119）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司，貨號K1622）；PCR 檢測試劑盒（德國Qiagen 公司，貨號208054）；蘇木素染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1004）；HRP 標記山羊抗大鼠IgG （武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號GB23302，稀釋比1 ∶200）；組化試劑盒DAB 顯色劑（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1211）。

1.3 儀器 OCT 包埋劑（日本Sakura 公司）；ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；脫色搖床（武漢賽維爾生物科技有限公司）；成像系統、正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠適應性喂養3 d，隨機分為正常組、模型組、IL?10 干預組、安胰顆粒組。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，左旋精氨酸（生理鹽水配成6%溶液） 按150 mg／100 g 給藥劑量每隔1 h 腹腔注射1 次，共3 次，誘導SAP 模型［5?6］。IL?10 干預組造模前1 次給予rh IL?10 10 000 U預處理后誘導SAP；安胰顆粒組造模前給予安胰顆粒（8 g／kg） 進行灌胃，連續預給藥3 d后誘導SAP；正常組和模型組予適量生理鹽水灌胃。

2.2 樣本采集 各組于造模后3、6、12 h 時間點腹腔注射10% 水合氯醛（0.4 mg／g），麻醉大鼠，開腹見不同程度血性腹水，肉眼見胰腺組織水腫、出血或色蒼白壞死。摘取胰頭組織，一部分用于mRNA 提取（存于液氮），一部分用于病理學評分及免疫組化檢查（4%中性甲醛固定）。

2.3 胰腺組織NF?κBmRNA 測定 引物由賽默飛公司設計，引物序列見表1。TRIzol 法提取樣本總RNA，取2 μg RNA 進行去DNA 處理，采用Thermo 試劑盒進行逆轉錄，再取逆轉錄好的cDNA 作為模板進行RT?PCR 檢測，反應條件為95 ℃，2 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40次循環。以β?actin為內參，采用2-ΔΔct法進行數據分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.4 胰腺組織病理切片 取各組的部分胰腺組織，解凍并脫水，石蠟包埋成功后切為多個5 μm 樣本切片，經展片及烤片后脫蠟并分別進行蘇木素及伊紅染液染色，沖洗、脫水、脫蠟、風干封片后在光學顯微鏡下取10 個視野攝片保存。經病理學評分后顯示造模成功。

2.5 胰腺組織iNOS、COX?2 測定 取4%中性甲醛固定的樣本，切取所需部位組織塊按常規步驟脫水浸蠟包埋及切片，展片、撈片、控片、烤片處理后對組織切片進行浸泡、修復、孵育、DAB 顯色、蘇木素染色、脫水等處理后封片保存，拍照，采用免疫組化累積光密度值（IOD） 分析方法（每組內每張切片隨機挑選至少3 個200 倍視野進行拍照），將相同的黃棕色判讀為陽性作為選擇標準，用Image?Pro Plus 6.0 進行分析，計算每張照片陽性的累積光密度值。

2.6 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以（） 表示。正態分布且方差齊時，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法；不滿足正態分布或方差不齊時，采用Kruskal?Wallis 非參數檢驗并作組間多重比較。按α ＝0.05檢驗水準。

3 結果

3.1 胰腺組織損傷及病理學觀察 正常組見正常白色胰腺組織，無明顯腹水，病理標本見完整胰腺小葉及腺泡結構。模型組開腹見大量深紅色血性腹水，腹水量隨時間增加而增加，胰腺組織模糊不清呈暗紅色，伴滲血或壞死；病理下見胰腺小葉、腺泡、細胞間隙增寬，胰腺小葉結構改變，大量炎癥細胞浸潤，腺泡腫脹、空泡化、壞死，且發生時間早。IL?10 干預組及安胰顆粒組開腹見紅色血性腹水，腹水量較模型組少，胰腺組織水腫呈蒼白色或見點狀出血，胰腺邊界模糊；病理下見胰腺小葉輕度水腫、間隙增寬、灶性或點狀壞死，其水腫、變性壞死、炎癥細胞浸潤程度較模型組減輕。各組病理切片見圖1。

圖1 造模后6 h 各組大鼠胰腺組織病理學（HE，×200）Fig.1 Image of pancreatic histopathology of each group six hours after modeling （HE，×200）

3.2 胰腺組織NF?κBmRNA 表達檢測 左旋精氨酸誘導SAP 模型3、6、12 h 后，模型組胰腺組織NF?κBmRNA 表達均升高（P＜0.01）；經IL?10 及安胰顆粒干預后，NF?κBmRNA 表達降低（P＜0.05）；IL?10 干預組及安胰顆粒組各時間點比較，差異無統計學意義，見表2。尚不能認為安胰顆粒組抑制NF?κBmRNA 表達能力較IL?10 干預組佳。

表2 安胰顆粒對胰腺組織NF?κB mRNA 表達的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Anyi Granules on pancreatic expression of NF?κB mRNA（，n＝10）

表2 安胰顆粒對胰腺組織NF?κB mRNA 表達的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Anyi Granules on pancreatic expression of NF?κB mRNA（，n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

3.3 胰腺組織iNOS 的表達檢測 左旋精氨酸誘導SAP 模型3、6、12 h 后，模型組大鼠胰腺組織iNOS 表達升高（P＜0.01）；經IL?10 及安胰顆粒干預后，iNOS 表達降低（P＜0.01）；IL?10 干預組及安胰顆粒組各時間點比較，差異無統計學意義，見表3。尚不能認為安胰顆粒組抑制iNOS 的表達能力較IL?10 干預組佳。各組胰腺組織iNOS 第12 小時的免疫組化見圖2。

表3 安胰顆粒對胰腺組織iNOS 表達的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Anyi Granules on pancreatic iNOS expression （， n＝10）

表3 安胰顆粒對胰腺組織iNOS 表達的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Anyi Granules on pancreatic iNOS expression （， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

圖2 免疫組化檢測造模后12 h 各組胰腺組織iNOS、COX?2 表達（×200）Fig.2 Detection of pancreatic iNOS and COX?2 expression of each group twelve hours after modeling by immunohistochemical （×200）

3.4 胰腺組織COX?2 的表達檢測 左旋精氨酸誘導SAP 模型3、6、12 h 后，模型組胰腺組織COX?2表達升高（P＜0.01），且12 h 達到高峰；經IL?10 及安胰顆粒干預后，COX?2 表達降低（P＜0.01）；IL?10 干預組及安胰顆粒組各時間點比較，差異無統計學意義，見表4。尚不能認為安胰顆粒組抑制COX?2 的表達能力較IL?10 干預組佳。各組胰腺組織COX?2 第12 小時的免疫組化見圖2。

表4 安胰顆粒對胰腺組織COX?2 表達的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Anyi Granules on pancreatic COX?2 expression （， n＝10）

表4 安胰顆粒對胰腺組織COX?2 表達的影響（， n＝10）Tab.4 Effects of Anyi Granules on pancreatic COX?2 expression （， n＝10）

注：與正常組比，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

4 討論

炎性浸潤及微循環障礙同時影響SAP 進程及預后，眾多研究已表明炎癥因子參與SAP 的發生，但從微循環角度研究尚有不足，本實驗從NF?κB對其下游因子iNOS、COX?2 影響的角度闡明SAP時發生微循環障礙的可能機制。NF?κB［7?9］是人體中普遍存在的核轉錄因子，通常存在于細胞質且無活性，SAP 時NF?κB 受到刺激后迅速激活并移至細胞核中，易位過程中介導眾多炎癥基因的表達，進一步激活促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子及包括iNOS、COX?2 在內的誘導酶等，而這些因子或酶的表達又進一步激活更多的NF?κB，如此循環往復，炎癥反應及微循環障礙持續加重。本實驗中，模型組造模后3 h NF?κB 表達明顯升高，12 h達到本實驗觀察的峰值，表明NF?κB 在SAP 開始的12 h 內呈遞增趨勢。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS） 廣泛存于內皮細胞、巨噬細胞、血小板和胰腺中，在分子水平上調控NO 合成。其分為3 種亞型［10］，其中神經型和內皮型在細胞及組織中持續存在但只生成極少量的NO；誘導型只有在如NF?κB 的下游因子（腫瘤壞死因子、白介素1、干擾素?α 等） 刺激下才生成，誘導型NOS的生成能刺激產生大量的NO。NO 是一種參與微循環和炎癥反應的高活性自由基，在機體中不僅是一種信號分子也是內毒素或促炎細胞因子，與SAP的嚴重程度密切相關［3］。SAP 過程中，iNOS 生成增加引起NO 過度表達，造成胰腺微血管難治性擴張，血流瘀滯，胰腺微循環缺血，同時引起的胰腺缺血?再灌注損傷過程中生產大量氧自由基，直接損害包括胰管內皮細胞在內的胰腺微循環血管系統，引起嚴重的微循環障礙［11?13］。本實驗發現模型組iNOS 的表達明顯升高，進一步證實iNOS 與SAP 的密切關系。COX?2 是花生四烯酸轉化為前列環素、血栓素和前列腺素等生理活性類花生酸的限速酶，在機體正常情況下在組織中不可測或表達極少，只有炎癥發生時才會表達，因此其異常表達與炎癥輕重程度密切相關［14］。SAP 過程中，NF?κB 可誘導COX?2 生成，COX?2 的代謝產物中前列腺素E2 （prostaglandin，PGE2） 在炎癥、胰島破壞和抑制胰島素分泌中起著關鍵作用［15?16］。COX?2亦可刺激NO 生成增多，協同前列腺素直接影響胰島細胞增殖、分化和血管生成，加快胰島細胞凋亡而使胰腺微循環障礙進一步加重［17?18］。NO 還可增強COX?2 的活性，二者在相關研究的免疫反應性評分中表現出顯著相關性［18］，在SAP 中協同發揮作用，共同參與并加重胰腺微循環障礙。

安胰顆粒是以大承氣湯加減理氣止痛、清熱解毒、活血祛瘀等藥而成。SAP 早期即可出現微循環障礙，而輕癥胰腺炎中并不明顯，因此安胰顆粒特別選擇了甘遂、紅藤、莪術三藥，輕癥胰腺炎則不用，是安胰顆粒臨床應用加減使用的特點。而紅藤、莪術用于重癥急性胰腺炎的文獻鮮見，紅藤功效清熱解毒、活血止痛、治腸癰腹痛要藥，莪術破血祛瘀、行氣止痛，二藥主要針對重癥胰腺炎熱毒血瘀互結的病理本質所用。方中紅藤通過調節NF?κB信號通路，抑制細胞因子TNF?α、IL?1β、IL?10 的分泌，下調血栓素2 水平及血栓素2 與前列環素2 的比值等來抑制或延緩炎癥反應及損害，改善血管通透性以達到有效的抗炎抗凝作用［19?22］。莪術可有效降低NF?κB 的表達來減少血管內皮因子（如NO） 的表達，NO 生成的減少既能緩解血液粘稠易凝狀態，還能較好的抑制COX?2，以減少其下游的PGE2介導的炎癥免疫反應，達到緩解SAP 病情的目的［23?27］。安胰顆粒的配伍特點對于SAP 不僅清熱通腑、理氣止痛，更有活血祛瘀之功，為其能有效治療SAP 提供進一步的可靠證據。在本實驗中，由左旋精氨酸誘導的SAP 在經過安胰顆粒灌胃預處理3 d 后，水腫、炎性浸潤、細胞損傷及胰腺出血壞死較模型組明顯減輕，胰腺組織中NF?κB、iNOS、COX?2 表達也明顯下降，表明安胰顆粒可能通過抑制三者的表達以減輕SAP 時的炎癥反應及微循環障礙程度。

本實驗表明，SAP 發生時核因子?κB 大量表達，iNOS、COX?2 表達也顯著增加，安胰顆粒能顯著降低SAP 大鼠胰腺組織NF?κB、iNOS、COX?2表達，通過階梯性降低細胞因子的表達而改善胰腺微循環障礙的嚴重程度從而達到治療SAP 的目的。