HPLC 法同時測定當歸中8 種成分

鄧雪琪 管小軍 黃娜娜 李 俊

（1.云南中醫藥大學， 云南昆明650500； 2.云南昊辰健康有限公司， 云南昆明650500； 3.云南省民族特色養生理論與健康產品工程實驗室， 云南昆明650500）

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.） Diels 的干燥根，主產于甘肅，在云南、四川、湖北等省也有種植，目前市場上除“岷歸”外，大多銷售的為“云當歸”［1］。當歸臨床應用廣泛，具有補氣止血、行血、養血、和血之功［2］，其化學成分主要包括有機酸類、苯酞類、香豆素類等，還有一些氨基酸類［3?4］。其中阿魏酸是當歸有機酸的主要活性成分，具有抗炎、抗老年癡呆、補血活血等多種功效，也是2015 年版《中國藥典》 含有量測定項下的規定成分［5?6］。綠原酸具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗病毒等廣泛的藥理活性［7］。苯酞類化合物包括藁本內酯、洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、丁烯基苯酞等，是當歸揮發油的主要成分，其中藁本內酯的含有量最高，該類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多種藥理作用［8?11］。香豆素類化合物包括蛇床子素、補骨脂素、異歐前胡素、香柑內酯、歐前胡素等［4，12］，該類化合物具有抗腫瘤、抗高血壓、抗心肌缺血、抗炎、止痛等多種藥理活性［13?14］。色氨酸是一種人體必需的氨基酸，人體自身無法合成［15］。近年來，隨著當歸市場需求量的增加，由于云當歸的優良品質，也逐漸成為了當歸市場的重要組成部分，種植面積在不斷擴大。為了解不同當歸藥材的品質，本研究建立HPLC 法檢測不同當歸中的指標性成分，以期為其進行更加全面的質量評價提供參考。

1 材料

LC?2030 高效液相色譜儀、UV?2450 紫外分光光度計（日本Shimadzu 公司）；1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AB265?S 電子分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；HH?S4數顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Ultimate C18色譜柱（月旭材料科技有限公司）；Li?chroshper C18色譜柱（漢邦科技有限公司）。

色氨酸 （140686?201303）、綠原酸 （110753?201415）、阿魏酸 （110773?201614）、歐前胡素（110825?201616） 購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯Ⅰ （P02F9F54165）、洋川芎內酯H（P02F9F54165） 購自上海源葉生物科技有限公司；丁烯基苯酞（CHB161018） 購自成都克洛瑪生物科技有限公司；Z?藁本內酯（MUST?17041012） 購自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其余為分析純。

收集傳統采收期當歸藥材共21 批，分別于云南維西、麗江、大理、瑞麗、甘肅實地采收，以及收購于各藥材公司，經云南中醫藥大學陳紹田副教授鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。信息見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、歐前胡素、Z?藁本內酯、丁烯基苯酞對照品適量，加甲醇制備成每1 mL 含色氨酸50 μg、綠原酸70 μg、阿魏酸55 μg、洋川芎內酯Ⅰ16 μg、洋川芎內酯H 5 μg、歐前胡素190 μg、Z?藁本內酯500 μg、丁烯基苯酞50 μg 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末（過3 號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液過濾，取續濾液，即得。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 色譜條件 Ultimate C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.085%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～15 min，10%～12%A；15～20 min，12%～22%A；20～56 min，22%～62%A；56～60 min，62%～70%A；60～65 min，70%～10%A）；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃。理論塔板數按阿魏酸峰計算應不低于5 000。結果見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密取各對照品適量，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含色氨酸84.40 μg、綠原酸120.40 μg、阿魏酸92.00 μg、洋川芎內酯Ⅰ25.30 μg、洋川芎內酯H8.72 μg、歐前胡素321.60 μg、Z?藁本內酯880.00 μg、丁烯基苯酞82.26 μg 的混合對照品貯備液，分別精密吸取上述混合對照品貯備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合對照品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣，以各對照品峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.1” 項下混合對照品溶液，在“2.3” 項色譜條件下連續進樣6 次，每次10 μL，測得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯、洋川芎內酯H、歐前胡素、Z?藁本內酯、丁烯基苯酞峰面積RSD 分別為0.76%、0.43%、0.80%、1.50%、1.63%、0.62%、0.48%、2.04%。表明儀器精密度好。

2.6 重復性試驗 精密稱取當歸藥材粉末（批號20180401），按“2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下連續進樣，測得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯、洋川芎內酯H、歐前胡素、Z?藁本內酯、丁烯基苯酞含有量RSD 分別為1.42%、1.70%、1.18%、1.84%、1.99%、1.76%、1.45%、1.92%。表明該方法重復性好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12 h 進樣10 μL，測得色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯、洋川芎內酯H、歐前胡素、Z?藁本內酯、丁烯基苯酞峰面積RSD 分別為1.68%、1.58%、1.63%、1.75%、2.08%、1.10%、0.98%、1.76%。表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取當歸藥材粉末（過3 號篩） 6 份，每份約0.5 g，置250 mL 錐形瓶中，加入各成分含有量已知的混合對照品貯備液2 mL，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣，計算加樣回收率。各成分平均回收率 97.60%～ 101.22%，RSD 0.89%～2.51%。

2.9 樣品含有量測定 取不同產地的當歸藥材粉末（過3 號篩） 約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下測定8 種成分的峰面積，以外標法計算含有量，結果見表3。2.10 聚類分析 以21 批樣品中8 種有效成分含有量數值為變量，采用SPSS 19.0 軟件對樣品進行系統聚類分析，利用歐氏距離作為樣品的測度。縱坐標為樣品編號，結果見圖2，當聚類標定距離為25 時，21 批樣品聚為兩大類，樣品S1、S3 聚為第一類，其余樣品聚為第二類。當聚類重新標定距離為5 時，樣品S7、S9、S12 聚為第二小類，樣品S4～S6、S18、S20 聚為第三小類，樣品S2、S8～S11、S13～S17、S21 聚為第四小類。

表3 各成分含有量測定結果（%）Tab.3 Results of content determination of various constituents （%）

圖2 21 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of twenty?one batches of samples

結合含有量結果發現，第一類樣品是8 種成分總含有量最低的一批，也是Z?藁本內酯含有量最低的一批，第二類樣品是總含有量最高的一批，也是Z?藁本內酯和阿魏酸含有量最高的一批，而其他成分的含有量對最終的總含有量結果影響不顯著，由此可見，Z?藁本內酯和阿魏酸含有量對當歸藥材的質量具有顯著影響。Z?藁本內酯含有量高的情況下，阿魏酸以及其他的幾個苯酞類化合物洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、丁烯基苯酞的含有量一般也較高，所以，為了保證當歸藥材的質量，必須全面對阿魏酸和Z藁本內酯2 種主要成分同時進行控制，再輔以其他成分，對當歸藥材質量進行綜合評價。結合聚類分析和含有量測定結果來看，云南維西所產2 批、云南瑞麗所產1 批當歸為活性成分總含有量最高，表明云當歸質量亦佳，當歐式距離為25 時，云南所產的當歸共有18 批與甘肅當歸聚為一類，可見，云南所產當歸藥材與甘肅所產當歸質量相似。

3 討論

3.1 波長選擇 對8 種成分進行全波長掃描結果初選260、280 nm 為因素進行考察。結果表明，相比于280 nm 波長，260 nm 波長下色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H 的峰面積吸收值均有不同程度的減小，而歐前胡素和丁烯基苯酞峰面積吸收值260 nm 卻比280 nm 高的多。由于綠原酸、洋川芎內酯H 等成分含有量較低，且阿魏酸作為主要檢測指標，在260 nm 波長下峰面積吸收值減小近一半，而丁烯基苯酞和歐前胡素雖然在280 nm 波長下減小較多，但是由于這2 種成分含有量較高，在280 nm 下也能被穩定檢測，最終選用280 nm 為檢測波長。

3.2 提取溶劑選擇 選定70% 甲醇、80% 甲醇、100%甲醇3 種溶劑，超聲和回流提取2 種方式進行考察。結果顯示70%、80%、100%甲醇為溶劑，均能提取到阿魏酸松柏酯，甲醇比例越高，提取到的阿魏酸松柏酯含有量越高。但實驗過程中發現，隨著時間延長，阿魏酸松柏酯含有量會逐漸減少，阿魏酸松柏酯在甲醇溶液中不穩定，且受熱遇光也極易分解成阿魏酸和松柏酯［16?17］。所以采用70%甲醇。

4 結果與討論

本研究以當歸中色氨酸、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯H、歐前胡素、Z?藁本內酯、丁烯基苯酞為指標，建立HPLC 法測定其含有量，選取了云南維西、麗江、瑞麗、大理，甘肅等產地不同批次樣品進行檢測，由8 種成分的含有量可知不同產地藥材、同一產地不同批次藥材有效成分含有量各不相同，如有些批號藥材就能檢測到綠原酸，有些藥材歐前胡素含有量較高，而主要的成分阿魏酸、Z?藁本內酯含有量并無顯著性差異，表明云南出產的云當歸與傳統道地產區的甘肅當歸質量相似。

本研究建立HPLC 法同時對當歸中8 種成分進行含有量測定，該方法可用于當歸藥材質量的全面評價。當歸化學成分復雜，當中包括很多熱不穩定、見光易分解、易水解的化學成分，其中以阿魏酸松柏酯、Z?藁本內酯為代表，作為當歸藥材中含有量較高且有顯著藥理活性的成分，無疑是評價當歸藥材品質的重要指標。阿魏酸松柏酯無論在藥材中，還是單獨作為純品，室溫條件下都極易發生水解，Z?藁本內酯在當歸藥材中可穩定存在，而它的純品在室溫條件下易降解，生成多種異構化產物［18］。怎樣解決對照品的純度及穩定性，并將其穩定用于當歸藥材的含有量測定還有待進一步研究。