五子衍宗丸補腎澀精有效部位的譜效關系

張 希 廖宇嬌 楊 卓 陳志敏 李文兵 胡昌江*

（1.成都中醫藥大學藥學院， 四川成都611137； 2.成都市婦女兒童中心醫院藥學部， 四川成都611137；3.四川新綠色藥業科技發展有限公司， 四川成都611930）

五子衍宗丸作為中醫補腎益精的經典名方，臨床上廣泛用于治療腎虛腰痛、遺精滑精、陽痿不育等癥［1］，由枸杞子、炒菟絲子、覆盆子、蒸五味子、鹽車前子組成。方中枸杞子、菟絲子共為君藥，補腎益精，益陰扶陽；輔以覆盆子、五味子固腎澀精；佐以車前子利尿泄熱［2］，諸藥合用，具有補中有瀉、澀中有利、補陰扶陽的配伍特點，主要用于男性陽痿不育、遺精早泄、生殖能力低下等癥。

復方發揮療效是多味藥共同協作的結果，相比單味藥來說，其治療范圍更廣泛確切，但其所含成分也更復雜多樣。因此，為了更加明確復方發揮療效的物質基礎成分并尋找到其集散群，就需要根據藥物作用建立相應動物模型，將物質基礎定位到某極性部位來進行研究。

本實驗以NO、FSH、T 作為檢測指標，篩選五子衍宗丸補腎澀精有效部位，建立其HPLC 特征圖譜，采用灰關聯度法研究它與補腎澀精藥效之間的關聯性［3?4］，以期為闡明該制劑物質基礎提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子各10 批，均由四川新綠色藥業科技發展股有限公司提供，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為正品。聚山梨酯?80 （成都市科龍化工試劑廠）；綠原酸 （批號110753?201415）、金絲桃苷（批號11521?201205）、槲皮素（批號100081?201610）、山柰酚（批號110861?201611） 對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。大鼠FSH （批號TWRYNAIQ）、T （批號 C0116080151 ）、NO （批號20180609） ELISA 試劑盒均由武漢賽維爾生物技術有限公司提供。乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 動物 清潔級SD 大鼠，雄性，體質量180～220 g，由四川達碩動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（川） 2015?030。

1.3 儀器 Shimadzu LA?2040C 四元泵高效液相色譜儀（日本島津株式會社）；KQ5200DB 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；控溫冰箱（青島海爾電冰箱生產廠）；JY20002 電子天平（0.01 g，上海方瑞儀器有限公司）；XPE26 電子天平（百萬分之一，梅特勒?托利多儀器有限公司）；TG?16 離心機 （四川蜀科儀器有限公司）；DPD?700 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；摩爾1810A 細胞型超純水機（上海摩勒科學儀器有限公司）；RE?52A 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 有效部位篩選

2.1.1 提取物制備 炒菟絲子、鹽車前子、蒸五味子均按照2015 年版《中國藥典》 方法炮制，采用醇水雙提法以使其提取完全。按照《中國藥典》 比例，取枸杞子20 g、炒菟絲子20 g、覆盆子10 g、鹽車前子5 g、蒸五味子2.5 g，粉碎（過2 號篩），依次用6 倍量95%、70%、50%乙醇回流提取，每次1.5 h，合并濾液，作為醇提液；剩余藥渣加入6 倍量水回流提取2 次，每次1 h，合并濾液，作為水提液，醇提液減壓回收至無醇味后與水提液合并，濃縮得到藥液浸膏，加入適量硅藻土拌干，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水索氏提取，即得［5］，揮干溶劑后加入5%吐溫?80 助溶，再加水制成10 g／mL 相應溶液。

2.1.2 對大鼠NO、T、FSH 水平的影響 取SD 大鼠60只，隨機分為正常組、模型組、石油醚組、乙酸乙酯組、水飽和正丁醇組、水部位組，每組10 只，除正常組外其他各組大鼠每天均灌胃給予20 mg／kg 雷公藤多苷溶液［6］，連續30 d。造模后4 h，除正常組、模型組外其他各組大鼠均灌胃給予“2.1.1” 項下相應提取物溶液（10 g／kg），正常組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，連續30 d。

末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉后腹動脈取血，4 000 r／min 離心15 min，取上層血清，-20 ℃下保存，檢測卵泡刺激素 （FSH）、睪酮 （T）、一氧化氮（NO） 水平。通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（） 表示，組間比較采用完全隨機設計單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為差異具有統計學意義，結果見表1。由此可知，與模型組比較，水飽和正丁醇提取物組NO、T 水平升高（P＜0.05），FSH 水平降低（P＜0.05）；與正常組比較，水飽和正丁醇提取物組三者水平均無明顯變化（P＞0.05），故選擇該部位作為有效部位。

表1 各提取物對大鼠NO、T、FSH 水平的影響（， n＝10）

表1 各提取物對大鼠NO、T、FSH 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Wondasil?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.2% 磷酸 （B），梯度洗脫（0～20 min，3%～7% A；20～25 min，7%～10% A；25～40 min，10%A；40～65 min，10%～15% A；65～100 min，15%～30% A；100～110 min，30% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 按“2.1.1” 項下方法制備各提取物后，精密稱取水飽和正丁醇提取物適量，甲醇?氯仿（7 ∶3） 溶解（由于水飽和正丁醇部位極性大，單用甲醇不能完全溶解），定容至10.0 mL，制成10.46 g／L 溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度試驗 取同一批“2.2.2” 項下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 重復性試驗 取同一批“2.2.2” 項下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.3.3 穩定性試驗 取同一批“2.2.2” 項下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，于0、2、6、12、24、48 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.2.4 指紋圖譜生成 在“2.2.1” 項色譜條件下建立10批樣品指紋圖譜，見圖1～2。共有20 個共有峰，其中7 號峰為綠原酸，11 號峰為鞣花酸，12 號峰為金絲桃苷，14號峰為槲皮素，18 號峰為山柰酚。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 對照指紋圖譜

2.3 譜效關系研究 通過兩序列曲線幾何形狀的相似程度來判斷聯系的緊密性，曲線越接近，相應序列之間的關聯性越大，其大小用關聯度來表示，用于判別因素對指標的影響程度［7?8］。

2.3.1 原始數據變換 采用均值化變換法，不僅消除了指標量綱和數量的影響，而且能更全面地反映原始數據中各指標變異程度和相互影響程度的信息，與中心化處理相比其所得結果更準確。本實驗選擇NO、FSH、T 水平作為母序列，各共有峰峰面積作為子序列，變換原始數據后得到均值化處理序列。

2.3.2 絕對差序列 經數據變換后的母序列記為 ｛X0（t） ｝，子序列記為｛Xi（t） ｝。在時間t＝k時（k為峰號），母序列記為｛X0（k） ｝，子序列記為｛Xi（k） ｝，兩者絕對差序列Δ0i（k） ＝｜X0（k） -Xi（k） ｜（1≤i≤m）。

2.3.3 關聯系數 取分辨系數ρ＝0.5 （ρ≤0.546 3 時分辨率最高，通常取0.5），計算公式為關聯系數η（k） ＝（Δ0imin＋ρΔ0imax） ／ （Δ0i＋ρΔimax）。

2.3.4 關聯度 參考文獻［9］ 報道計算關聯度r，公式為（n為子序列的數據數量），結果見表2。由此可知，對藥效貢獻較大（關聯度＞0.6） 的共有峰有17 個，依次為7 號峰（綠原酸） ＞14 號峰（槲皮素） ＞16 號峰＞13 號峰＞15 號峰＞4 號峰＞3 號峰＞17 號峰＞9 號峰＞8 號峰＞18 號峰（山柰酚） ＞10 號峰＞6 號峰＞20 號峰＞5 號峰＞1 號峰＞19 號峰。

表2 HPLC 指紋圖譜與補腎澀精藥效的關聯度

3 討論

FSH 主要作用于睪丸的曲細精管上皮細胞，可通過誘導青春發育期睪丸間質細胞的成熟和增加間質細胞受體的數量，從而間接促進精子生成；T 是睪丸的主要內分泌產物，它作為經典的內分泌因子是精子發生的關鍵局部調節劑，兩者共同促進睪丸曲細精管生長發育，促進精子發生和成熟［10?11］。NO 在男性生殖系統功能的調節中具有重要作用，它參與了精子發生、獲能，并影響其質量，介導陰莖勃起、調節睪丸血供、激素分泌等，從而影響男性生育能力［12?14］。本實驗發現，與正常組比較模型組大鼠的T、NO 水平顯著下降，FSH 水平顯著升高，經五子衍宗丸水飽和正丁醇部位干預后三者水平明顯改善，表明該部位可促進生殖器官發育生長，維持睪丸生精調控。

本實驗建立了五子衍宗丸水飽和正丁醇部位的HPLC指紋圖譜，該方法簡便，重復性良好。考察了乙腈?0.2%磷酸、乙腈?0.4%磷酸、［乙腈?甲醇（10 ∶1）］ ?0.4%磷酸、乙腈?0.1%甲酸流動相體系，發現乙腈?0.2%磷酸分離效果最佳；考察了3 種柱溫，發現30 ℃時色譜峰分離效果較好；采用DAD 檢測器考察了254、290、365 nm 檢測波長，發現在254 nm 處色譜峰數量最多，分離效果最佳。

石油醚部位單用甲醇溶解時呈渾濁，不能完全溶解，放置后有沉淀析出，故又同時比較了石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水部位的HPLC 指紋圖譜。為了防止溶劑對指紋圖譜的影響，本實驗結合文獻和樣品性質，發現甲醇?氯仿（7 ∶3） 對各部位浸膏均能溶解。

灰色關聯度是研究變量間相關關系的常用統計方法，可預測各成分與藥效之間的關聯性，對樣本容量、數據分布規律的要求較低，容易程序化，而且在數據較少或分布不典型時結果更穩定［15］。通過對五子衍宗丸各提取部位的HPLC 指紋圖譜進行比較后發現，主要有效化學成分群集中在水飽和正丁醇部位，色譜峰數量也最多，主要有效成分也能指認；乙酸乙酯部位藥效也有一定的改善趨勢，提取過程中也發現有較多有效成分溶出，雖然色譜峰數量與某些峰含有量比石油醚、水部位豐富，但與水飽和正丁醇部位相比還有較大差異。由此推測，五子衍宗丸有效成分集散群可能大多集中在乙酸乙酯、水飽和正丁醇部位的極性區間內。

綜上所述，本實驗初步揭示了五子衍宗丸補腎澀精有效部位的譜效關系，可為今后相關藥效成分的定性鑒定和定量分析奠定基礎，也為闡明其物質基礎提供依據。