基于生物信息學探討血府逐瘀湯治療慢性心力衰竭的機制

宋金玉 孫笑宇 吳東寧 王慶峰

（1.山西藥科職業學院制藥工程系， 山西太原030031； 2.北京豐臺右安門醫院中醫科， 北京100069；3.遼寧中醫藥大學中西醫結合學院， 遼寧沈陽110032）

血府逐瘀湯為中醫臨床經典名方，首載于清代王清任《醫林改錯》。方中以桃仁、紅花、川芎、赤芍、當歸活血祛瘀；牛膝祛瘀血，通血脈，引血下行；柴胡疏肝解郁，升達清陽；桔梗開宣肺氣，載藥上行，合枳殼升降氣機，開胸行氣，使氣行則血行；地黃涼血清熱，合當歸又能養陰潤燥，使祛瘀而不傷陰血；甘草調和諸藥。諸藥相合，共奏活血祛瘀，行氣止痛之功［1］。

血府逐瘀湯在臨床及基礎領域取得了諸多研究成果［2］，但限于該方構成復雜，有效成分眾多，因此對于其分子機制的研究尚顯不足。另一方面，現有的機制研究則多集中該方對單一靶點／信號通路的調控，借以分析其起效機制［3?4］。然而，復方的作用靶點眾多，對應通路也多有重疊，因此，如何驗證及理清所獲得的結果是其分子研究的難點及重點之一。而借助系統生物學及網絡藥理學，探索復方起效的靶點及通路網絡，是當前復方研究的有效策略［5］。

考慮到血府逐瘀湯在慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF） 治療中，獲得了較好的臨床效果［6］，本研究則以此為切入點，考察該方對CHF 的治療機制。首先應用主成分分析，確定方內藥物之間的相互關系及血府逐瘀湯起效的核心分子靶點；應用CTD 及DisGeNet 數據庫構建CHF 的背景網絡，并以血府逐瘀湯作用的分子靶點對其進行映射，以獲得血府逐瘀湯作用于CHF 的分子靶點及核心分子靶點［7?8］；對上述分子靶點進行GO 注釋和KEGG 通路功能富集，并最終確定血府逐瘀湯治療CHF 的物質基礎及分子機制。

1 材料與方法

1.1 血府逐瘀湯的數據集的采集與處理 在TCMSP 數據庫（http： ／ ／ lsp.nwsuaf.edu.cn ／ tcmsp.php） 檢索獲得血府逐瘀湯內飲片的化學成分及對應靶點。再完成數據集的建立后，進一步遵照Lipinski 規則對所獲得的靶點進行的篩選，具體篩選條件如下［9］①分子量（MW） ＜500；②脂水分配系數（Alog P） ≤5；③氫鍵供體數目（Hdon） ≤5；④氫鍵受體數目（Hacc） ≤10；在上述原則下，獲得該組方的組成成分及對應靶點。整理獲得的分子靶點信息，建立藥物（橫坐標） ?分子靶點（縱坐標） 數據集，該數據集內的具體數值，為藥物作用不同分子靶點的重復值。

1.2 血府逐瘀湯內藥物的主坐標分析 應用SIMCA 14.1軟件對“1.1” 項下所得的數據進行主成分分析。根據各單味藥所對應分子靶點重復值，統計出藥物分子靶點的集中度，應用TBtools v0.66 軟件的Heatmap 包對該重復值制作熱圖，并根據熱圖的色塊變化情況，分析血府逐瘀湯內各個單味藥的靶點集中度關系；SIMCA 軟件內，對獲得的各藥物集中度的差異情況制主成分分析圖，最終確定各藥物之間的相互關系；對“1.1” 項下全部藥物作用的分子靶點重復總值排序，取前50，將其定義為核心分子靶點。應用TBtools v0.66 軟件的Heatmap 包對上述靶點的重復值做均一化處理后，制作熱圖，以考察上述核心分子靶點在各藥物內的分布情況。

1.3 CHF 背景網絡 以CTD 數據庫 （http： ／ ／ctdbase.org／）［10］篩選CHF 相關的分子靶點。在“Diseases” 搜索框中輸入“Chronic Heart Failure”，獲得CHF 的分子靶點信息；考慮到CTD 數據庫所獲背景網絡較大，本研究又選擇了DisGeNet 數據庫（http： ／ ／www.disgenet.org／）［11］進行補充，在 “Diseases” 搜索框中輸入 “Congestive heart failure；CUI： C0018802：：”，獲得了另一組CHF 的靶點信息，取兩者交集，以獲得的分子靶點信息為本研究的初始數據，并進一步以Cytosacpe3.7.1 軟件構建CHF 的背景網絡。

1.4 血府逐瘀湯治療CHF 潛在靶點及功能富集 以“1.1” 項下的血府逐瘀湯分子靶點，對“1.3” 項下的CHF 背景網絡進行映射，從而獲得血府逐瘀湯治療CHF 的潛在靶點，并構建“藥物-有效成分-分子靶點” 網絡；以“1.2” 項下獲得的血府逐瘀湯核心靶點，對上述網絡進行映射，以獲得血府逐瘀湯治療CHF 的潛在核心靶點，最終構建“藥物-有效成分?核心分子靶點” 網絡；應用WebGestalt 數據庫 （http： ／ ／www.webgestalt.org）［12］及Cytoscape 3.7.1 軟件的ClueGO 包，對獲得的潛在靶點進行KEGG 和GO 功能富集，以確定血府逐瘀湯對于CHF 治療的分子機制。

2 結果

2.1 血府逐瘀湯主要成分作用靶標篩選 經過系統篩選，共獲得11 個藥物的共計717 種有效成分。經過降重后，共獲得588 種有效成分。獲得的靶點分布情況如表1所示。

表1 血府逐瘀湯內各藥物的有效成分及分子靶點統計

進一步對上述分子靶點的重復值整理后，應用SIMCA軟件統計不同藥物的聚類，再以TBtools 軟件可視化后，可獲得不同藥分子物靶點分布之間的差異性區別（圖1）。由圖1 可知，血府逐瘀湯內功能最為相近的藥對為川芎?當歸。柴胡?當歸、赤芍?當歸、地黃?當歸的分子靶點分布也比較接近。

圖1 血府逐瘀湯中單味藥分子靶點分布關系

以SIMCA 軟件對血府逐瘀湯內不同藥物做主成分分析，如圖2 所示，柴胡、當歸、川芎、赤芍在同一個象限內，可推測上述四者作用的分子靶點較為密切，為一個大的分子功能模塊；與此同時，紅花、牛膝及桔梗在同一個象限內，可推測上述三者作用的分子靶點較為密切，為另一個大的功能模塊。而桃仁同其他藥物相比，作用的分子靶點分布富相似度較低，結果提示，相比于其他藥物，桃仁所實現的功能更為特殊。

圖2 血府逐瘀湯中單味藥主成分分析

2.2 血府逐瘀湯分子靶點的權重分析 獲得的唯一作用靶點共計913 個，其中，重復值較高的有PTGS2 （375 個），GABRA1 （276 個），PTGS1 （218 個），CHRM1 （189 個），ADH1C （187 個），CHRM2 （164 個），CHRM3 （146 個），GABRA2 （146 個） 等，重復值前50 的分子靶點（核心分子靶點） 在不同藥物內的分布情況如圖3 所示。

2.3 血府逐瘀湯有效成分對充血性心衰的作用靶點 CTD數據庫所獲得的CHF 分子靶點共計65 771 個，選擇其中經過實驗驗證（帶M 標記） 及臨床驗證的基因（帶T 標記）的，共計113 個。DisGeNet 數據庫獲得的CHF 的分子靶點共計883 個。取兩者交集作為研究的背景網絡，最終獲得本研究擬采用的CHF 背景網絡分子靶點，共計98 個。獲得的分子靶點數據對其進行映射，獲得血府逐瘀湯治療的CHF 的潛在靶點共計43 個；以上述43 個分子靶點及“2.1” 項下獲得的藥物、化合物和分子靶點的分布情況，構建“藥物?化合物?分子靶點” 的網絡如圖4 所示。

圖3 血府逐瘀湯內藥物的作用核心分子靶點分布情況

圖4 血府逐瘀湯作用于CHF 的藥物?有效成分?分子靶點網絡

對該網絡內自由度的度值分析可知，血府逐瘀湯成方藥物中，甘草的度值最高，為114，提示其共有114 個有效成分可作用于CHF 的分子靶點，其次是柴胡（88），川芎（77），當歸（43） 及紅花（38）。而桃仁的度值最低，僅為4。另一方面，篩出的43 個分子靶點平均度值為29.3，共有8 個分子靶點大于平均度值；而化合物的平均度值為4.7，共有139 個化合物的自由度大于平均自由度，共有8個化合物的自由度大于15，證明上述成分可調控的CHF 的潛在靶點較多，為血府逐瘀湯內的主要成分。圖4 內度值較高的有效成分及分子靶點信息如圖5 所示。

圖5 血府逐瘀湯作用于CHF 的有效成分及核心分子靶點自由度分布

本研究篩選了血府逐瘀湯內重復值較高的50 個靶點。將其映射入圖4 的網絡內，最終篩選出其作用的主要分子靶點包含6 個，分別為PTGS2、PTGS1、NOS2、PPARG、GSK3B 及ADRB1。引入“2.1” 項下藥物及有效成分的信息后，構建血府逐瘀湯作用于CHF 的“藥物?有效成分?核心分子靶點網絡” 如圖6 所示。

對圖6 的網絡的自由度度值分析后可知，甘草（111）、柴胡（84）、川芎（73）、當歸（42） 和紅花（35） 的度值高于平均度值。考慮到“藥物?核心分子靶點” 的度值同“藥物?分子靶點” 的度值類似，結果進一步驗證，上述6個分子靶點為血府逐瘀湯治療CHF 的核心分子靶點。為進一步的理清上述有效成分在CHF 治療過程中的起效機制，本研究將篩選出的43 個核心靶點進行功能富集，并重點考察篩選出的6 個核心分子靶點的分子功能。以最終確定血府逐瘀湯對于CHF 的治療機制。

2.4 血府逐瘀湯對充血性心衰的治療機制 由圖7～8 的統計結果可知，血府逐瘀湯內43 個核心靶點主要調節的通路有3 類，分別為調控內皮細胞功能（血液剪切力及動脈粥樣硬化通路），調控缺氧應激反應（HIF?1 信號通路），誘導心肌細胞凋亡及血管重構（TNF 和AMPK 信號通路），血管炎癥（IL?17 信號通路） 等。根據功能富集結果可知，在CHF 的過程中，血府逐瘀湯通過調控一系列通路，多角度、多靶點緩解疾病的發生和發展。

3 討論

血府逐瘀湯具有活血祛瘀、行氣止痛之功［1］，能夠有效的治療慢性心力衰竭。現代藥理學研究表明，桃仁、紅花可改善血流動力學、抗凝血［13］；赤芍可舒張血管［14］，川芎可改善心肌缺血［15］等作用。盡管目前針對血府逐瘀湯內藥物的藥理學活性的研究已經較為深入，但其治療CHF 機制的報道卻不多。

本研究嘗試應用主成分分析方法，對方內藥物的關系進行分析以證實其配伍關系。由結果可知，同其他藥物相比，君藥桃仁作用的分子靶點分布相似度較低，推測桃仁在CHF 治療的過程中，同其他藥物起效機制有所不同。赤芍?川芎在方內主要輔佐為桃仁紅花活血化瘀，而該藥對的相似度較高。臣藥牛膝的功效祛瘀通脈、引瘀血下行，因此，其分子靶點分布同赤芍?川芎藥對差異性較遠。使藥中，當歸?地黃藥對相似度較高，兩藥除祛瘀外，亦有協同養血涼血潤燥的功效。桔梗主要作用于上焦，引氣上行，而枳殼作用于中焦，理氣寬中行滯，因此，桔梗?枳殼藥對差異性較大。柴胡疏肝理氣，其分子靶點的分布情況同赤芍及川芎較為接近。

本研究獲得的 “中藥?成分?分子靶點” 網絡中，salicylic acid （水楊酸）、naringenin （柚皮素）、lauric acid（月桂酸）、isorhamnetin （異鼠李素）、luteolin （木犀草素）、kaempferol （山柰酚） 以及quercetin （槲皮素） 等自由度較高。其中，以阿司匹林為代表的水楊酸類藥物［16］，是臨床治療CHF 的常用一線藥物；而Testai 等［17］研究證實槲皮素，可以通過激活mitoBK 通道，以實現心肌保護作用，另外，槲皮素也可直接作用于血管平滑肌細胞（VSMCs）［18］，從而直接調節該細胞的氧化應激表型，并進一步的降低動脈粥樣硬化的發生。上述有效成分，都被廣泛的報道可治療CHF。異鼠李素也是黃酮的一種，大量研究顯示，異鼠李素有較強的心血管保護作用。其潛在的機制包含NF?κB 通路的調節［19］及直接作用于SIRT1 分子靶點，從而抑制心肌細胞的凋亡［20］等；木犀草素也有較強的心肌保護作用，其可直接抑制異丙腎上腺素所致的心衰大鼠的外周淋巴細胞損傷［21］，同時，木犀草素也可通過抑制ROS 分子，進而激活的MAPK 通路以實現心肌保護作用［22］。山柰酚也被證實有廣泛的心臟保護作用，其作用的表型包含炎癥抑制、氧化應激［23］，作用的通路包含NF?κB和PI3K／AKT／GSK3B 等［24］。槲皮素同山柰酚類似，也有較強的心臟保護作用。其可調節心臟的氧化應激、抑制炎癥反應，并改善心肌細胞的凋亡［25］；另外，槲皮素也直接影響心臟對NO 代謝的影響，進而緩解心肌的損傷［26］。

圖6 血府逐瘀湯作用于CHF 的藥物?有效成分?核心分子靶點網絡

在“中藥?成分?核心分子靶點” 網絡中，自由度最高的分子靶點分別為前列素內環氧化物合成酶2 （PTGS2）、前列素內環氧化物合成酶1 （PTGS1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ （PPARG）、糖原合成酶激酶3β （GSK3B） 及β1 腎上腺素受體（ADRB1） 等靶點。可確定，上述靶點是血府逐瘀湯治療CHF 的核心靶點。PTGS2 也稱為環氧合酶?2 （COX?2），COX?2 過表達會增加局部組織前列腺素（PG） 的合成，刺激炎癥反應，而其介導CHF 發病的主要原因正是通過誘導血管炎癥，并進一步誘發心臟肥大及重塑所致［27］。PTGS1是花生四烯酸代謝產生血栓素A2 過程中關鍵限速酶，通過抑制PTGS1 的活性，可以大幅降低血栓素的表達，并進一步限制血小板的過度聚集［28］。NOS2 為誘導型一氧化氮合成酶，可調節體內NO 的濃度［29］。隨血液內NO 濃度的增加，產生相應的抗炎及抗動脈粥樣硬化作用［30］。PPARG 主要參與脂類的分解代謝等［31］，針對其在心臟類疾病的功能研究不多，但是大量的疾病多態性研究顯示，PPARG 同心血管疾病的發生密切相關［32?33］。GSK3B 主要參與糖代謝調節及胰島素應答［34］，同時嵌套進了大量炎癥反應的通路。其同CHF 的聯系主要是通過NF?κB 信號通路得以實現［35］，而NF?κB 信號通路則是CHF 發病過程中，重要的血管炎癥及心肌細胞凋亡通路［36］。ADRB1 其主要在腎上腺素的功能實現過程中，發揮信號傳導作用。該靶點多應用于遺傳多態性研究，特別是在心血管疾病易感性研究中，ADRB1 被廣泛的報道［37?38］。綜上可知，血府逐瘀湯可通過調節上述6 個核心分子靶點實現其對CHF 的治療目的。

富集分析結果可知，在該治療過程中主要涉及通路可能是血液剪切力及動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis），HIF1 信號通路，AMPK 信號通路、TNF 信號通路及IL?17 信號通路等。作為CHF 發生過程中，最重要的上游通路，血液剪切力及動脈粥樣硬化通路可直接介導一系列CHF 的下游通路，如MAPK、NF?κB、PI3K、及JAK 等［39］。而其通路本身，除了信號傳導功能外，也直接調節血管內皮細胞的功能。HIF1 通路主要調節心臟的代償性，可以有效的緩解心臟由缺氧所帶來的代償性損傷［40］。然而，在CHF 的過程中，隨著心臟長時期的缺氧，HIF1 的不斷上調，持續的氧化應激，會加速心肌細胞的凋亡，引起心臟損傷［41］。另一方面，CHF 所誘發的炎癥反應會造成局部低氧環境，亦會激活HIF1 通路，并進一步的激活HIF1 下游的NF?κB 通路，加重炎癥損傷［42］。同HIF1 的功能類似，AMPK 信號通路也同心肌的代謝有關。隨著氧攝入的不足，AMPK 信號通路會隨之活化，其可通過啟動內源性的能量保護機制，從而提升心肌細胞對于缺氧狀態的耐受。該通路是重要的缺氧保護通路，而隨著AMPK 信號通路的抑制，心肌細胞的凋亡會持續進行［43］。而血府逐瘀湯在AMPK 信號通路上有多個作用靶點，可以證明其有潛在心肌缺氧保護作用。TNF 信號通路同CHF 作用關系的機制有二，除了作為上游信號調控下游的NF?κB 通路外；TNF 也可通過 TNFR1?TRADD?FADD 途徑招募 FLICE（FADD?like ICE） ／MACH （MORT1?associated CED?3 homo?log） ／caspase?8，再激活caspase?3，最終誘導細胞凋亡［44］；推測該路徑在心肌細胞凋亡的過程中，也發揮了重要的作用。IL?17 則是CHF 重要的炎癥通路，針對誘發了CHF 的對心肌炎癥損傷的研究較多，其可通過介導的炎癥反應，直接損傷心肌細胞，從而加速心血管疾病、心功能損傷的進展過程。另外，隨著的IL?17 的激活，其可釋放多種炎癥因子和中性粒細胞趨化因子，加劇血管內的炎癥反應，并進一步的促進動脈粥樣硬化及心臟重塑的發生［45?46］。同時，IL?17 又可直接調控其下游的NF?κB 信號通路，從而誘發心肌細胞凋亡的發生。此外研究發現，物質代謝、生物調節、生物膜跨膜傳輸、外源信號傳導等生物過程。結果提示，血府逐瘀湯對于CHF 的治療，主要是通過對物質代謝的調節及生物信號傳導的控制得以實現。由上述結果可知，血府逐瘀湯治療CHF 的機制包含調控內皮細胞功能，緩解缺氧應激反應，保護心肌細胞凋亡及血管重構和降低血管炎癥反應等。

圖7 血府逐瘀湯核心作用靶點的KEGG 通路分析

圖8 血府逐瘀湯核心作用靶點的GO 功能分析

4 結論

作為經典方劑，血府逐瘀湯成方復雜，其臨床可治療多種心血管相關疾病。經典藥理學已經對血府逐瘀湯對心臟的治療機制進行了深入全面的研究，然而，在分子機制層面，限于該方作用靶點較多，藥物配伍關系復雜，極大的限制了其進一步的深入研究。本研究借助生物信息學手段，對該方進行系統分析，對于其中藥物的配伍關系，進行了初步研究，并進一步的應用網絡藥理學手段，對其作用靶點進行分析，并最終獲得了血府逐瘀湯治療CHF 的潛在機制，以此為基礎，針對已經獲得的目標靶點及通路做進一步深入的驗證，最終獲得血府逐瘀湯對心臟系統疾病治療的機制。另一方面，也為傳統方劑的現代研究，提供新的思路和方法。