不同形態(tài)烏藥根HPLC 指紋圖譜建立

章 源 杜偉鋒 羅云云 趙金凱 應(yīng)澤茜 葛衛(wèi)紅 陸兔林

（1.江干區(qū)中醫(yī)院， 浙江杭州310020； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心， 浙江杭州311401；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇南京210046）

烏藥為樟科植物烏藥Lindera aggregata（Sims） Kosterm.的干燥塊根，具有行氣止痛、溫腎散寒的功效，用于寒凝氣滯、胸腹疼痛、氣逆喘急等［1］。烏藥主要含有揮發(fā)油、生物堿及呋喃倍半萜及其內(nèi)酯類成份?，F(xiàn)代藥理研究表明，烏藥不僅具有鎮(zhèn)痛、抗炎［2］、抗微生物、抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)胃腸動(dòng)力［3］、緩解胃腸痙攣等作用，而且還對泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、婦科疾?。?］等有顯著療效。

陳藏器的《本草拾遺》 是最早收錄烏藥的典籍［5］，《日華子本草》 《湯液本草》 《本草求真》 對烏藥也均有記載。在《本草綱目》 中，李時(shí)珍將烏藥列入香木類，屬木部中品?！吨匦拚徒?jīng)史證類備用本草》 記載［6］有“烏藥……根狀似山芍藥及烏樟根，色黑褐，作車轂紋，橫生。八月采根，直根不用。” 《本草圖經(jīng)》 載有“烏藥……根以作車轂紋，形如連珠者為佳?！?/p>

目前，浙江、上海等省市的中藥飲片炮制規(guī)范記載烏藥以塊根入藥［7］。2015 年版《中國藥典》 及其前幾部，均明確規(guī)定塊根呈連珠狀，以質(zhì)嫩、粉性大、橫斷面淺棕色者為佳，質(zhì)老、不呈紡錘狀的直根，不可供藥用［1］。烏藥原藥材中，以不呈紡錘狀的直根量較大，紡錘根比較有限，老根也很少。烏藥直根和老根在藥用品質(zhì)方面是否不及烏藥紡錘根，目前還沒有系統(tǒng)地比較研究。本研究建立烏藥塊根HPLC 指紋圖譜結(jié)合主成分分析其成分，以期為烏藥質(zhì)量控制、合理利用和資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 戴安U3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Al?204 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；BP210S 電子天平 （十萬分之一，德國Sartorius 公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 烏藥內(nèi)酯（批號W?029?151111，純度≥98.0%） 購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司；烏藥醚內(nèi)酯（批號111568?201204，純度99.5%），購自中國食品藥品檢定研究院；烏藥醇（批號ST16930120MG，純度≥98.0%） 購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。甲醇、甲酸、三乙胺、鹽酸（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏藥處理 取新鮮烏藥根，根據(jù)不同形態(tài)，分得紡錘狀塊根10 批、直根10 批和老根6 批，趁鮮切片，60 ℃條件下烘干得烏藥片。取不同批烏藥片打粉過80 目篩，用于供試品溶液制備。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取烏藥內(nèi)酯、烏藥醚內(nèi)酯、烏藥醇對照品適量，加甲醇溶解，制得含烏藥內(nèi)酯32.99 μg／mL、烏藥醚內(nèi)酯 36.17 μg／mL、烏藥醇39.0 μg／mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 稱取烏藥粉末約0.25 g，于10 mL量瓶中，加正己烷8 mL，超聲 （100 W，40 kHz） 處理1 h，冷卻，正己烷定容，搖勻，取續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 色譜條件 參考文獻(xiàn)［8］，Agilent Eclipse XDB ?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） ?水（B），梯度洗脫（0～5 min，35%A；5～25 min，35%～55%A；25～33 min，55%～63% A；33～40 min，63%～62% A；40～60 min，62%～100% A；60～65 min，100%～35% A；65～70 min，35%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得的圖譜相似度均大于0.995，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，測得6 份樣品圖譜的相似度均大于0.995，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在“2.4” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，測得的圖譜相似度均大于0.995，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 HPLC 指紋圖譜建立

2.6.1 色譜峰歸屬 將26 批不同形態(tài)烏藥根（S1～S10 為烏藥紡錘狀塊根；S11～S20 為烏藥直根；S21～S26 為烏藥老根），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，得26 批烏藥樣品HPLC 色譜圖。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004 A 版” 對指紋圖譜進(jìn)行分析。其中保留時(shí)間穩(wěn)定的共有峰15 個(gè)，在相同色譜條件下，以色譜峰保留時(shí)間和紫外掃描圖譜為比較參數(shù)，將烏藥指紋圖譜與混合對照品溶液進(jìn)行比較，指認(rèn)3 個(gè)共有峰，分別為3 號峰烏藥內(nèi)酯、5 號峰烏藥醚內(nèi)酯、7 號峰烏藥醇，指紋圖譜見圖2。

圖2 26 批不同形態(tài)樣品HPLC 指紋圖譜

2.6.2 相似度分析 利用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)軟件對不同形態(tài)烏藥根HPLC 指紋圖譜與共有峰模式進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表1?？芍?，烏藥紡錘根和烏藥直根相似度較高，均在0.94 以上，表明化學(xué)成分相對一致；烏藥老根相似度較低，表明和烏藥紡錘根、直根相比化學(xué)成分組成有較大差異。

表1 26 批不同形態(tài)樣品相似度

2.7 主成分分析

2.7.1 特征值和方差貢獻(xiàn)率 依據(jù)3 種不同形態(tài)26 批樣品指紋圖譜，以篩選的15 個(gè)共有峰峰面積為分析變量，將其導(dǎo)入SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，得到主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率、碎石圖，見表2、圖3。以特征值1為提取標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到3 個(gè)主成分，特征值λ1＝8.040，λ2＝2.762，λ3＝1.950，特征值λ1貢獻(xiàn)率53.602%，λ2的貢獻(xiàn)率18.416%，λ3的貢獻(xiàn)率13.002%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.019%。

表2 主成分特征值和貢獻(xiàn)率

圖3 26 批不同形態(tài)樣品碎石圖

由表3 載荷矩陣可知，第1 主成分主要反映了烏藥內(nèi)酯、烏藥醚內(nèi)酯、烏藥醇和4、8、10、11、12、13、14 號色譜峰的主要信息，第2 主成分主要反映2、6、9 號色譜峰的主要信息，第3 主成分主要反映了1、15 號色譜峰的主要信息。

以3 個(gè)主成分為變量得到載荷圖，其表示結(jié)果和初始因子載荷矩陣表相同，在三維圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn)所代表的成分就是主成分中權(quán)重系數(shù)占據(jù)較大的成分，表明其在決定不同形態(tài)烏藥根質(zhì)量差異上起著重大的作用。已標(biāo)定的烏藥內(nèi)酯、烏藥醚內(nèi)酯和烏藥醇均落在第1 主成分，且都有較大的權(quán)重值。見圖4。

表3 初始因子載荷矩陣

圖4 主成分分析載荷圖

2.7.2 綜合評價(jià) 以各主成分對應(yīng)貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，計(jì)算3 種形態(tài)26 批樣品的主成分得分和綜合得分，并進(jìn)行排序，結(jié)果見表4。綜合得分較高的前5 位分別為S16、S8、S5、S1、S14，其中3 個(gè)為塊根、2 個(gè)為直根。從綜合得分排名上看，塊根、直根和老根質(zhì)量差異未有清晰的界線。而從主成分1 得分排名看，塊根和直根差異不顯著，而6批老根排名最低。

3 討論

藥材不同藥用部位、不同采收時(shí)期都會(huì)影響其質(zhì)量和臨床應(yīng)用［9?11］。桑有桑葉、桑枝、桑葚等，溫郁金有片姜黃、溫莪術(shù)、溫郁金，茯苓有茯苓和茯苓皮，蓮有蓮房、蓮子、蓮子心和蓮須等不同部位；連翹有青翹和老翹，橘有青皮和陳皮不同采收時(shí)期藥材，這些藥雖藥用部位、采收時(shí)期不同，然皆可作臨床藥用。而有些中藥如山茱萸要去核［12］，牡丹皮要刮去粗皮，除去木心［13］；金銀花宜開花前采收［14］，茵陳老枝不可藥用，這些中藥因部位、采收時(shí)期不同就有可藥用和不可藥用的區(qū)別。

表4 不同形態(tài)烏藥根主成分得分、綜合得分和排名統(tǒng)計(jì)

烏藥在2015 年版《中國藥典》 和大部分省市中藥飲片炮制規(guī)范中規(guī)定為紡錘狀塊根加工而成，直根和老根不可藥用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，烏藥塊根和直根第1 主成分得分都較高，且未有明顯區(qū)分，而老根排名均最低。主成分1主要反映了烏藥內(nèi)酯、烏藥醚內(nèi)酯、烏藥醇等主要活性成分的相關(guān)信息，表明老根中烏藥內(nèi)酯、烏藥醚內(nèi)酯和烏藥醇等成分含有量較低。從3 個(gè)主成分的綜合得分分析，雖然烏藥塊根和直根得分大部分較高，且老根在第3 主成分中均有較高得分，表明老根相較于塊根、直根可能有其他的次生代謝產(chǎn)物生成。

雖然有些中藥部位不能加工成中藥飲片使用，但并不代表它沒有藥用價(jià)值。對非藥用部位需進(jìn)行多種途徑利用、加工和深加工［15］，對其中的多糖類、氨基酸類、三萜及其苷類、核苷類、黃酮類、有機(jī)酸類進(jìn)行粗放低值、轉(zhuǎn)化增效及精細(xì)高值等利用［16］。烏藥直根無論是主成分還是其他成分，并不亞于烏藥塊根［8］，更何況烏藥植株中直根占有相當(dāng)大的比重，如不加以開發(fā)利用，將造成烏藥資源的流失浪費(fèi)。