基于紅外光譜指紋圖譜的肉桂提取物質(zhì)量控制

李 寧 李 瀅 劉 暘 郭明里 任 超 黃 茜 楊兆祥 張建文*

（1.昆藥集團(tuán)股份有限公司， 云南昆明650100； 2.大理大學(xué)， 云南大理671000）

中藥肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹皮。肉桂始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。中醫(yī)傳統(tǒng)認(rèn)為肉桂具有補(bǔ)火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效，臨床用于陽痿宮冷、腰膝冷痛、腎虛作喘、虛陽上浮、眩暈?zāi)砍唷⑿母估渫础⑻摵聻a、寒疝腹痛、痛經(jīng)經(jīng)閉等證的治療［1?2］。現(xiàn)代研究表明肉桂中主要含有揮發(fā)油、二萜及其糖苷、黃烷醇及其多聚體，此外還含有黃酮及其苷類、木脂素及其苷類、簡單芳香類、多糖類等多種類型的化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗補(bǔ)體、抗腫瘤、抗菌等藥理作用［3］。

肉桂用于預(yù)防和治療病毒感染的研究報(bào)道極少。近期美國福克斯健康新聞報(bào)道在家養(yǎng)肉桂植物中發(fā)現(xiàn)抗病毒活性成分［4］，但未見具體的研究結(jié)果。經(jīng)文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn)以色列特拉維夫大學(xué)已在中國知識(shí)產(chǎn)權(quán)局獲得了一個(gè)與肉桂提取物抗病毒相關(guān)的專利［5］，經(jīng)仔細(xì)分析該專利只對(duì)肉桂抗病毒成分的制備和抗病毒結(jié)果做了簡短描述，沒有活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)以及質(zhì)量控制方法的詳細(xì)分析。最近有研究報(bào)道肉桂的水提物或從肉桂中制備的花青素與多酚類形成的多聚體可以有效的阻斷H7N3和HIV 進(jìn)入細(xì)胞從而表現(xiàn)出顯著的抗病毒作用［6?8］。根據(jù)上述信息，課題組制備了肉桂水溶性抗病毒有效部位KPC?rg1，該部位為大分子水溶性多酚，且具有糖類結(jié)構(gòu)片段［9］。使用激光束投射實(shí)驗(yàn)證明KPC?rg1 溶液呈現(xiàn)典型的丁達(dá)爾效應(yīng)，暗示KPC?rg1 在溶液中以溶膠態(tài)存在。課題組對(duì)KPC?rg1 抗病毒活性進(jìn)行系統(tǒng)分析［9］，再次證明該有效部位對(duì)多種病毒有顯著的抑制活性，而且認(rèn)為KPC?rg1 擁有的抗病毒活性與KPC?rg1的膠體性質(zhì)有關(guān)。當(dāng)KPC?rg1 膠體碰上病毒顆粒后會(huì)立即與之結(jié)合形成非常穩(wěn)定的超納米結(jié)構(gòu)，從而阻止病毒侵入細(xì)胞，即所謂“原位固化滅活效應(yīng)”。基于KPC?rg1 擁有的這一特殊的病毒滅活機(jī)制，課題組認(rèn)為KPC?rg1 不但可用于各類皰疹病毒如帶狀皰疹病毒和單純皰疹病毒感染外用治療性藥物的開發(fā)，還可以用于感染性極強(qiáng)的包膜類病毒如H1N1和HIV 病毒滅活疫苗制備的探索。

肉桂水溶性抗病毒有效部位的化學(xué)成分復(fù)雜，研究認(rèn)為其分子量大于或等于10 kDa［5］。由于分子量大，極性強(qiáng)，溶解度低，缺乏有效的分離手段，至今尚未從中分離得到單體化合物并鑒定結(jié)構(gòu)。目前，肉桂及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)多以揮發(fā)油及其他小分子次生代謝產(chǎn)物（如桂皮醛、肉桂酸） 為化學(xué)指標(biāo)，建立相應(yīng)的含有量測定及指紋圖譜分析方法［2］。這些方法難以滿足如KPC?rg1 的水溶性有效部位的質(zhì)量控制要求。由于質(zhì)量控制方法缺失，難以保證KPC?rg1 質(zhì)量的穩(wěn)定性及均一性，進(jìn)而難以保證其安全性及有效性。

近年來，紅外光譜指紋圖譜在中藥指控領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展［10?14］。該方法具有自身鮮明的技術(shù)特點(diǎn)： 樣品前處理簡單，基本不使用有毒、有害試劑，分析速度快，操作簡單，分析成本低。紅外光譜指紋圖譜基于分子中官能團(tuán)振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的能級(jí)躍遷，直接反映化學(xué)結(jié)構(gòu)，無需化學(xué)對(duì)照品，能夠同時(shí)對(duì)樣品多種成分進(jìn)行分析表征，反映樣品宏觀（整體） 化學(xué)信息，體現(xiàn)中藥作用的整體性和模糊性。

本研究采用中紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析KPC?rg1 的指紋圖譜，以期探索符合KPC?rg1 特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同原料、不同制備工藝及不同儲(chǔ)存時(shí)間的KPC?rg1 進(jìn)行比較分析，以期為KPC?rg1 的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料

肉桂藥材于2015 年5 月購自云南昆明螺螄灣中藥材市場，產(chǎn)地云南。錫蘭肉桂Cinnamomum zeylanicumBl.于2015 年10 月購于美國，產(chǎn)地斯里蘭卡。陰香Cinnamomum burmanni（Nees et T.Nees） Blume 藥材于2015 年10 月購自廣西玉林中藥材市場，產(chǎn)地廣西。所有藥材經(jīng)昆藥集團(tuán)股份有限公司李寧博士鑒定為正品，憑證標(biāo)本存放于昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院天然產(chǎn)物部。BrukerTensor 27紅外光譜儀（德國Bruker 公司）。紅外光譜測定壓片用KBr為光譜純。KPC?rg1 制備用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 KPC?rg1 制備 參照文獻(xiàn) ［9］，將藥材粉碎，過60 目篩，10 倍量水20 ℃浸泡提取3 次，每次2 h。提取液過濾，取濾液，濃縮，加入0.3 mol／L 酸性磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），以鹽酸調(diào)pH 至3.0，靜置。取沉淀部分，即得。并在此基礎(chǔ)上對(duì)工藝參數(shù)加以調(diào)整，樣品信息見表1。

2.2 紅外光譜測定 紅外光譜分析過程中室內(nèi)溫度保持20～25 ℃，空氣相對(duì)濕度保持30%～40%。將待測樣品置于干燥器中24 h 以上，精密稱取各待測樣品2.0 mg，分別與100 mg 干燥的KBr 混合，于瑪瑙研缽中在紅外燈下充分研磨，壓制成透明薄片，放入紅外光譜儀測定。光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描累加次數(shù)16 次，重復(fù)測定3 次，掃描時(shí)扣除H2O 和CO2的干擾。

2.3 光譜處理方法與評(píng)價(jià) 將紅外光譜儀采集的數(shù)據(jù)（平均圖譜） 導(dǎo)入OriginPro 8 軟件，經(jīng)過二階導(dǎo)數(shù)變換，分別繪制紅外指紋圖譜原始圖譜和二階導(dǎo)數(shù)圖譜。將OriginPro 8 軟件處理過的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2013 軟件，以平均數(shù)法分別生成紅外指紋圖譜原始圖譜共有模式和二階導(dǎo)數(shù)圖譜共有模式，以相關(guān)系數(shù)法計(jì)算各圖譜與相應(yīng)的共有模式圖譜的相似度。將Excel 2013 軟件處理過的二階導(dǎo)數(shù)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca 13 軟件，進(jìn)行主成分分析。

表1 樣品信息

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

3.1.1 樣品與KBr 混合比例 分別稱取樣品1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg 與100 mg KBr 研磨均勻后壓片，將制得的供試片置于紅外光譜儀中進(jìn)行測試，結(jié)果表明，樣品用量為2.0 mg 時(shí)，壓片效果較好，且紅外吸收峰強(qiáng)度較好。

3.1.2 掃描次數(shù) 將供試片置于紅外光譜儀中，依次調(diào)整掃描次數(shù)為2、4、8、16、32 進(jìn)行測試。結(jié)果表明，隨著掃描次數(shù)的增加，譜圖的重復(fù)性越好，但是測試時(shí)間增加。綜合各種因素，選擇掃描次數(shù)為16。

3.1.3 重復(fù)測定次數(shù) 將供試片置于紅外光譜儀中，樣品連續(xù)掃描2、3、5、8 次得到紅外圖譜。結(jié)果表明，測量次數(shù)越多，測得譜圖的重復(fù)性越好，但樣品測試時(shí)間越長，綜合各種因素，選擇樣品重復(fù)測定次數(shù)為3 次。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 精密度試驗(yàn) 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試片，并連續(xù)測定6 次，對(duì)比紅外指紋圖譜。結(jié)果所得譜圖的譜線重合，表明儀器精密度良好。

3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試片，分別置于紅外光譜儀中測定。結(jié)果所得譜圖的譜線重合，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批KPC?rg1 樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試片，置干燥器中保存，分別于0、1、2、3、4、5、8、12、24 h 測定所得紅外譜圖。結(jié)果顯示24 h內(nèi)所得紅外圖譜的譜線重合，表明樣品壓片后24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3 樣品檢測 按“2.2” 項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法分別對(duì)20 批樣品進(jìn)行紅外測試，按“2.3” 項(xiàng)下數(shù)據(jù)分析方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。20 批樣品紅外原始指紋圖譜見圖1。KPC?rg1 樣品紅外原始指紋圖譜于3 432、1 618、1 523、1 445、1 284、1 105 cm-1等區(qū)段有較為明顯的特征吸收峰，不同植物來源及不同制備方法得到的提取物指紋圖譜大體一致。

圖1 20 批樣品紅外原始指紋圖譜

S1～S10 為采用標(biāo)準(zhǔn)制備方法制備的KPC?rg1 樣品，選取S1～S10 以平均數(shù)法生成共有模式見圖2，20 批樣品以相關(guān)系數(shù)法計(jì)算與共有模式的相似度，計(jì)算結(jié)果見表2。4 000～400 cm-1范圍內(nèi)紅外指紋圖譜的相似度均大于0.950，16 批樣品高于0.990，表明其總體化學(xué)成分具有一定的相似性。S8、S9、S10 以及S14 的相似度低于0.990，表明其化學(xué)成分同共有模式有差異。總體而言，紅外原始指紋圖譜能夠?qū)PC?rg1 的化學(xué)成分進(jìn)行快速表征，但指紋圖譜的區(qū)分度不理想。

圖2 樣品紅外原始指紋圖譜共有模式圖

表2 20 批樣品紅外原始指紋圖譜相似度

為進(jìn)一步挖掘紅外指紋圖譜包含的化學(xué)信息，課題組對(duì)紅外原始圖譜進(jìn)行了二階導(dǎo)數(shù)變換分析。20 批樣品的紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜與共有模式見圖3～4，相似度見表3。二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜可在一定程度上減少圖譜重疊峰的疊加，提高圖譜的分辨率，體現(xiàn)更多的結(jié)構(gòu)信息。其中S1～S7 相似度均在0.950 以上，提示其化學(xué)一致性較好。S8～S10 的相似度低于0.950，特別是S9，相似度僅為0.768。該3 個(gè)樣品的制備時(shí)間距測試時(shí)間較長，經(jīng)歷了約6 個(gè)月的儲(chǔ)存期。KPC?rg1 含有多酚類物質(zhì)，在放置過程中容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。這一結(jié)果表明需進(jìn)一步深入研究其穩(wěn)定性并優(yōu)化儲(chǔ)藏條件。S11～S12 為工藝摸索過程中改變提取溫度的樣品，其相似度高于0.950，提示KPC?rg1 的化學(xué)成分對(duì)考察的提取溫度變化不敏感。S13、S14、S16、S17 為工藝摸索過程中改變鹽析pH 樣品，其相似度遠(yuǎn)低于正常工藝樣品，表明pH 在KPC?rg1 制備過程中非常重要。S15 改變了鹽析工藝的鹽溶液濃度，其相似度大于0.950，提示KPC?rg1 的化學(xué)成分對(duì)考察的鹽溶液濃度變化不敏感。S18～S20 為采用錫蘭肉桂及陰香制備的KPC?rg1 樣品，其相似度低于0.350，提示其物質(zhì)基礎(chǔ)同肉桂制備的KPC?rg1 樣品有較大的差異。二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜具有較好的區(qū)分度，不但能夠?qū)Σ煌参飦碓吹臉悠愤M(jìn)行區(qū)分判別，同時(shí)能夠反映制備工藝對(duì)產(chǎn)品化學(xué)成分的影響。

基于20 批樣品的紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜建立主成分分析模型。第一主成分（PC1） 和第二主成分（PC2） 的得分散點(diǎn)圖見圖5。所有樣品大致聚為兩類，S1～S12 以及S15 聚為一類，S13、S14 及S16～S20 聚為另一類。S1～S12以及S15 均為采用肉桂藥材制備的KPC?rg1。同相似度評(píng)價(jià)結(jié)果相似，改變提取溫度的樣品S11～S12 以及改變鹽析工藝鹽溶液濃度的樣品S15 與采用標(biāo)準(zhǔn)制備工藝的樣品S1～S10 聚為一類，提示其化學(xué)成分的一致性較好。采用錫蘭肉桂及陰香制備的樣品S18～S20 與以上樣品在得分圖上的分布有明顯的距離。改變鹽析pH 的樣品S13、S14、S16 及S17 與標(biāo)準(zhǔn)制備工藝的樣品S1～S10 也有明顯的區(qū)分。

圖3 20 批樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜

圖4 樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜共有模式圖

表3 20 批樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜相似度

剔除S13、S14 及S16～S20 后，對(duì)S1～S12 以及S15 共13 批樣品再次進(jìn)行主成分分析。得分散點(diǎn)圖見圖6。改變提取溫度的樣品S11～S12 以及改變鹽析工藝鹽溶液濃度的樣品S15 基本落入S1～S7 的范圍。儲(chǔ)存時(shí)間較長的樣品S8～S10 分布較為離散。

以上結(jié)果表明該主成分分析模型能夠反應(yīng)不同樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，有良好的鑒別能力。紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜主成分分析與相似度分析的結(jié)果趨向一致，分組結(jié)果相同。分析方法不同，其分析的依據(jù)與參數(shù)均有差異，從不同的角度出發(fā)，采用不同的分析方法，得到相同或相近的分析結(jié)果，表明2 種方法在分析此類問題上，較為可靠，可用于肉桂提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

圖5 20 批樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜主成分分析得分散點(diǎn)圖

圖6 13 批樣品紅外二階導(dǎo)數(shù)指紋圖譜主成分分析得分散點(diǎn)圖

4 結(jié)論

本研究首次采用中紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析研究KPC?rg1 的指紋圖譜，以期探索符合KPC?rg1 特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同原料，不同制備工藝及不同儲(chǔ)存時(shí)間的KPC?rg1 進(jìn)行比較分析。本實(shí)驗(yàn)建立的肉桂提取物紅外指紋圖譜檢測方法操作簡單，快速，具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性，能夠反映樣品宏觀（整體） 化學(xué)信息。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，不但能夠?qū)Σ煌参飦碓吹臉悠愤M(jìn)行區(qū)分判別，同時(shí)能夠反映制備工藝對(duì)產(chǎn)品化學(xué)成分的影響。該方法尤其適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清晰的復(fù)雜體系的質(zhì)量控制，能夠用于肉桂提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)并指導(dǎo)進(jìn)一步的制備工藝參數(shù)優(yōu)化，以期為KPC?rg1 的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。