蒙古柳逆境應答研究進展

張云鵬　許昕薷　戴紹軍　李瑩1

摘要 ? ?蒙古柳是楊柳科柳屬的灌木或小喬木，具有耐旱和鹽堿特性，是固沙造林、改良貧瘠土壤的優勢樹種之一，具有較高的生態效益、經濟效益和社會效益。本文綜述了蒙古柳的形態特征、鹽堿應答特性以及遺傳轉化體系等方面的研究進展，以期為深入研究蒙古柳逆境應答分子機理提供參考。

關鍵詞 ? ?蒙古柳;形態特征;逆境應答;基因

中圖分類號 ? ?S792.12 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）16-0102-02

Research ?Progress ?on ?Adversity ?Response ?of ?Salix ?linearistipularis

ZHANG Yun-peng 1 ? ?XU Xin-ru 1 ? ?DAI Shao-jun 2 * ? ?LI Ying 1

（1 Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration ，Ministry of Education，College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin Heilongjiang 150040; 2 Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life Sceences，Shanghai Normal University）

Abstract ? ?Salix linearistipularis belongs to Salix in Salicaceae， is shrub or dungarunga species with strong tolerance for drought and salineal-kaline. It is one of dominant tree species for sand-fixation， afforestation and barren soil improvement， which has high ecological， economic and social benefits. In this paper， the morphological characteristics， salinealkaline response and genetic transformation system of Salix linearistipularis were revie-wed. This will provide valuable information for better understanding of the molecular mechanisms of adversity response in Salix linearistipularis.

Key words ? ?Salix linearistipularis; morphological characteristic; adversity response; gene

蒙古柳（Salix linearistipularis），又稱筐柳，是楊柳科柳屬多年生木本植物，為灌木或小喬木。蒙古柳主產于我國陜北榆林地區，主要分布于東北、西北和中部地區，在蒙古和俄羅斯遠東地區也有分布[1]，常分布于海拔100～1 800 m的平原、低濕地、河湖岸邊及鹽堿化草甸。蒙古柳具有較強的抗逆能力，是蘇打鹽堿地內唯一具有群落分布的木本植物，也是我國松嫩平原鹽堿地區域內珍貴的鹽生木本植物資源。蒙古柳是菌根形成的宿主植物，其根系形成的菌根能使根部周圍土壤的pH值降低，能有效改善鹽堿地土壤環境[2]。但是，蒙古柳的人工引種栽培技術目前尚不成熟[3]，其耐鹽堿的分子生理學研究也十分匱乏。本文對蒙古柳形態特征、鹽堿應答特性以及遺傳轉化體系建立進行了綜述，以期為蒙古柳的推廣種植提供參考。

1 ? ?蒙古柳形態特征

蒙古柳株高2～8 m，為灌木或小喬木。樹皮為黃灰色至暗灰色，枝條暗綠至暗黃色，細長且無毛，柔軟叢生。葉片長8～15 cm、寬0.6～1.2 cm，托葉與葉片均為線形或披針形線狀。幼葉呈嫩綠色，葉片表面有絨毛，邊緣有腺齒;成熟后葉片呈深綠色，葉表面絨毛脫落，葉片背面呈灰白色。成熟的蒙古柳種子呈白綠色、深綠色或暗綠色，為類長圓柱形。種子頂端有凸起，由種臍、種脊和種阜組成。種子具有白色冠毛，無翅、刺、芒等附屬物，白色冠毛長度為種子長度的3～6倍。蒙古柳種子由種皮和胚構成，種皮較薄，由透明的角質層構成，側表面呈皺裙狀;胚具有2片子葉，由薄壁細胞構成，胚細胞大小、形狀幾乎一致，呈類圓形。蒙古柳植株結實率較高，種子無休眠現象。但蒙古柳種子萌發對土壤水分需求極為嚴格，只有在土壤含水量為100%～200%的條件下才能萌發，常生長在河邊、平原低濕地或湖岸邊，并且低溫保存有利于延長種子活性[4]。

蒙古柳是一種典型的雌雄異株植物，雌雄株存在明顯差異[5]。雄株的鮮重、干重、葉長寬、葉面積、上表皮角質層厚度及氣孔密度均大于雌株，而雄株葉片下表皮角質層厚度和氣孔密度卻小于雌株。生理指標測定發現，雌株體內游離脯氨酸、丙二醛、葉綠素含量均高于雄株，而相對電導率和可溶性糖含量低于雄株。利用掃描電鏡觀察蒙古柳成熟期葉片的顯微結構發現，雄株第1層柵欄組織厚度明顯小于雌株。此外，蒙古柳雌雄株花芽也存在顯著差別。在花芽分化初期，雄花花芽呈類三角形，雌花花芽呈類橢圓形，且雄花花芽大于雌花花芽;在花芽發育期，雄花花芽膨大伸長速率小于雌花花芽;成熟期，雄花花芽體積小于雌花花芽。雌花花芽頂部呈尖銳狀，花芽尖微翹與枝條呈一定角度;雄花花芽頂部平滑緊附于枝條。雌花雌蕊子房分化時間要長于雄花雄蕊分化時間，通常雌花雌蕊子房分化時間比雄花花藥分化時期提前1周左右。雌蕊蜜腺發達，在分化期持續發育，而雄蕊中未見明顯蜜腺。在花序期，雌雄花均為柔荑花序，雄花序比雌花序短，同時雄花壽命也短于雌花。雄花散粉后萎蔫脫落，雌花將繼續生長發育[5]。因此，在春季通過觀察花芽與小枝夾角、花芽萎蔫脫落程度、葉表皮毛的基本形態可初步確定蒙古柳的性別。

2 ? ?蒙古柳逆境應答研究

蒙古柳根系發達，生長迅速，萌芽力強，耐寒耐熱，對鹽堿、干旱等非生物脅迫有較強的適應力。錢路[4]分析蒙古柳種子抵御鹽、堿、干旱脅迫能力發現，用5% PEG6000處理的蒙古柳種子萌發率略高于未經處理的種子，而20% PEG6000處理的種子萌發被抑制，萌發率明顯低于未經處理的種子。可見，低濃度PEG6000可促進蒙古柳種子萌發。在鹽堿脅迫下，蒙古柳種子的萌發率、發芽勢、萌發指數、種子活力均一定程度受到鹽堿抑制，低濃度的NaHCO3（10～30 mmol/L）卻促進蒙古柳胚根的伸長[4]。在50 mmol/L NaCl和10 mmol/L NaHCO3脅迫處理下，已培養30 d的蒙古柳幼苗生長狀態優于未經處理的蒙古柳幼苗;100 mmol/L NaCl和40 mmol/L NaHCO3處理的蒙古柳幼苗能繼續生長，但葉片出現鹽害癥狀。對葉片和根的顯微結構觀察發現，鹽堿處理后氣孔關閉，同時氣孔下陷數量明顯增加，這可能有利于減少體內水分散失;鹽堿處理后根部結構改變，根的表皮和外皮層消失，皮層薄壁組織出現不規則分布，通氣組織消失，維管束初生木質部導管數量減少，但導管直徑增大，這可能有利于水分運輸，支持蒙古柳幼苗在鹽堿脅迫下繼續生長[4]。蒙古柳雌、雄株對鹽的耐受性存在差異，雌株的耐鹽堿能力更強[6]。

在鹽脅迫條件下，缺氮和氮過量都抑制蒙古柳種子萌發和根的生長。氮素過量對蒙古柳種子萌發和根生長抑制更明顯，植株氮素代謝（尤其是尿素代謝）的產物尿素和NH4+含量明顯高于缺氮植株。鹽脅迫下，更換不同形式氮源（尿素、精氨酸、硝酸鉀、氯化銨和硝酸銨）對植株的影響不同[7]。以硝酸鉀作唯一氮源時，蒙古柳種子萌發率未受影響，其體內尿素和NH4+含量沒有明顯變化;而分別以尿素、精氨酸、氯化銨和硝酸銨作唯一氮源時，隨著氮濃度升高，蒙古柳種子萌發率明顯降低，體內氮素代謝產物顯著升高。這可能是尿素、精氨酸、氯化銨和硝酸銨在氮素代謝過程中均能產生尿素并促進尿素代謝造成的。外源加入精氨酸酶抑制、脲酶抑制劑都能阻斷精氨酸分解產生尿素和尿素代謝，種子萌發率受抑制程度得到緩解，種子內尿素和NH4+含量也顯著性下降。可見，阻斷尿素生成與代謝可以緩解鹽脅迫對蒙古柳種子萌發造成的影響[7]。

3 ? ?蒙古柳鹽應答基因功能分析

利用RNA-sequence技術對未處理和100 mmol/L NaCl處理的蒙古柳葉片進行分析，鑒定出3 034個差異基因，其中上調表達基因1 397個，下調表達基因1 637個。GO富集分析顯示，這些基因富集于50個亞類中，主要包括次生代謝產物的生物合成、植物病原菌互作、植物激素信號轉導等代謝通路中[8]。利用RNA-sequence技術對蒙古柳萌動期雌花花芽、雄花花芽以及雌雄株葉芽進行分析，以雄株葉芽為對照，共有153個雄花花芽特異表達基因，這些基因主要參與果實成熟、花序形態形成、負調控長日照光周期、開花、葉片衰老5個代謝通路中;以雌株葉芽為對照，共有292個雌花花芽特異表達基因，主要參與生長素合成、胚乳發育、分生組織形成等[9]。

汪振娟[10]克隆得到定位于細胞核中的SaWRKY28基因。在80 mmol/L NaCl、6 mmol/L NaHCO3脅迫下，轉SaWRKY28基因擬南芥植株比野生型植株具有更強的耐鹽堿能力。由此可見，SaWRKY28轉錄調控因子在蒙古柳抵御鹽堿脅迫過程中發揮了重要作用。

南桂仙等[8]將轉基因擬南芥和野生型擬南芥在不同的逆境下進行抗性分析，結果發現，蒙古柳金屬硫蛋白基因在1.3 mol/L和1.5 mol/L NaCl、3 mmol/L和3.5 mmol/L NaHCO3、70 μmol/L和 80 μmol/L CuCl2、100 μmol/L和150 μmol/L CdCl2、0.8 mol/L和1 mol/L ZnCl2脅迫處理下，轉SaMT基因擬南芥種子的萌發率高于野生型;在150 mmol/L和170 mmol/L NaCl、3 mmol/L NaHCO3、3 mmol/L H2O2、100 μmol/L和150 μmol/L CdCl2、300 mmol/L和350 mmol/L Sorbital處理下，轉SaMT基因擬南芥根長度高于野生型。由此表明，蒙古柳金屬硫蛋白基因的過表達能顯著增強擬南芥植株對NaCl、NaHCO3、H2O2、CuCl2、ZnCl2、CdCl2的抗性。

4 ? ?蒙古柳遺傳轉化體系的建立

GUAN Q J等[11]初步建立了蒙古柳遺傳轉化體系，以蒙古柳葉片作為外植體，利用含有1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、30 g/L 萘乙酸（NAA）的MS培養基可獲得蒙古柳愈傷組織，經過不定芽分化和不定根誘導，獲得蒙古柳再生植株。利用農桿菌轉染的方式將pCXSN-gus質粒轉入幼嫩蒙古柳愈傷組織，可獲得轉基因植株。這為蒙古柳耐逆分子機理研究奠定了基礎。

5 ? ?展望

蒙古柳是我國北部重要的耐鹽堿樹種，易繁殖，生長快，萌芽力強。目前，對蒙古柳形態結構、繁殖方式、遺傳轉化以及逆境應答基因功能的研究十分有限[12-13]。在此基礎上，開展蒙古柳植物資源調查、耐逆品種選育，并利用整合組學與分子遺傳學技術深入揭示蒙古柳逆境應答分子機理是將來急需開展的工作[14-15]。

6 ? ?參考文獻

[1] 柳參奎.中國東北鹽堿地植物原色圖鑒[M].哈爾濱：東北林業大學出版社，2006.

[2] ISHIDA T A，NARA K，MA S R，et al. Ectomycorrhizal fungal community in alkaline-saline soil in northeastern China[J].Mycorrhiza，2009，19（5）：329-335.

[3] 羅偉祥，劉廣全，李嘉玨，等.西北主要樹種培育技術[M].北京：中國農業出版社，2007.

[4] 錢璐.環境因子對蒙古柳（Salix linearistipularis）種子萌發的影響[D].哈爾濱：東北林業大學，2015.

[5] 張美嬌.蒙古柳（Salix linearistipularis）雌雄株差異性分析[D].哈爾濱：東北林業大學，2016.

[6] 齊琪.蒙古柳雌雄株扦插苗對鹽堿脅迫的響應[D].哈爾濱：東北林業大學，2019.

[7] 魏芝玲.尿素代謝對蒙古柳耐鹽性的影響研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2019.

[8] 南桂仙，喬坤，高野哲夫，等.蒙古柳金屬硫蛋白的擬南芥遺傳轉化及抗性分析[J].基因組學與應用生物學，2015，34（1）：28-34.

[9] 孫亞軍.基于RNA-Seq的蒙古柳（Salix linearistipularis）雌雄花芽萌動期特異表達基因解析[D].哈爾濱：東北林業大學，2017.

[10] 汪振娟.SmWRKY28蛋白參與蒙古柳抗NaCl、NaHCO3脅迫的調節功能研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2016.

[11] GUAN Q J，HE M，MA H，et al.Construction of genetic transformation system of Salix mongolica：in vitro leaf-based callus induction，adventi-tious buds differentiation，and plant regeneration[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2017，132（1）：1-5.

[12] 馬書榮，李韞，石美玉，等.鹽堿脅迫對蒙古柳無性系生理特性的影響[J/OL].分子植物育種：1-13[2020-07-31].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20200226.2148.012.html.

[13] 南桂仙.蒙古柳（Salix linearistipularis）耐鹽相關基因的挖掘研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2014.

[14] 韓雪.山新楊高效遺傳轉化體系的建立及蒙古柳FOX山新楊抗性植株的獲得[D].哈爾濱：東北林業大學，2013.

[15] 郭瑤，吳建慧.蒙古柳的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2009，45（12）：1211-1212.

基金項目 ? 中央高校基本科研業務專項資金資助項目（2572018BS03;2572017ET01）。

作者簡介 ? 張云鵬（1995-），男，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生。研究方向：蒙古柳蛋白質組學研究。

通信作者

收稿日期 ? 2020-04-05