慢性HBV感染患者核苷類藥物治療后相應突變位點檢測及效果分析

張永榮

【摘 要】 目的：探析慢性HBV感染患者核苷類藥物治療后相應突變位點檢測方法及效果情況。方法：選取慢性HBV患者207例，實施實時熒光定量PCR方法擴增其血清HBV多聚酶區(qū)，并直接測序PCR產(chǎn)物。結果：8例經(jīng)ETV治療患者，共發(fā)生突變類型2種，最為常見的為rtT184A/G/I/S;66例經(jīng)ADV治療患者，共發(fā)生突變類型3種，最為常見的為rtA181V/T/S;5例LdT治療患者，共發(fā)生突變類型2種，最為常見的為rt M204I;128例LAM治療患者中，共發(fā)生突變類型4種，最為常見的為rtV207I/L/G。結論：多樣化為核苷類四五耐藥株的氨基酸突變特點，根據(jù)基因型耐藥檢測結果，待抗病毒失敗后對藥物給予及時更換。

【關鍵詞】 核苷類似物;慢性HBV感染;相應突變位點;效果分析

【中圖分類號】 R512.6 ? 【文獻標志碼】A ? 【文章編號】1005-0019（2020）17-221-01 ?本研究以我院接收的慢性HBV感染患者207例為研究對象，探究核苷類藥物治療后相應突變位點檢測情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月-2019年9月收治患者207例，男162例，女45例;（19-81）歲，平均（48.6±3.5）歲。根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》標準均已確診。檢測前，分別實施LdT、ADV、ETV和LAM等核苷類藥物進行抗乙肝病毒治療。前一晚禁食，翌日取適量靜脈血為標本。

1.2 基因測序方法

1.2.1 定量PCR擴增 真空下取3ml血液為標本，離心取50μl血清，加入濃縮提取液50μl，震蕩混勻后，在4℃的環(huán)境下靜置五分鐘，每分鐘15000r，在4℃環(huán)境下離心十分鐘，吸棄上清，加入裂解緩沖液40μl，劇烈震蕩無沉淀后，予短暫離心，在100℃高溫下加熱十分鐘，15000rpm，在4℃環(huán)境下離心五分鐘，取4μl上清置于25μl反應體系中。94℃五分鐘，94℃7秒、60℃50秒、40個循環(huán)，37℃恒溫保存。

1.2.2 酶解PCR產(chǎn)物 取3μl PCR酶解產(chǎn)物，加入SPA混合物2μl，并將其混合均勻。在37℃下放置1小時，在80℃下防止15分鐘，最后在4℃下保存。

1.2.3 PCR反應預測 取3μl PCR酶解產(chǎn)物，測序產(chǎn)物2μl與測序試劑1μl實施PCR擴增，96℃1分鐘，96℃10秒、50℃5秒、60℃4分鐘、循環(huán)25次，在4℃恒溫狀態(tài)下保存。

1.2.4 產(chǎn)物純化的測序 （1）將醋酸鈉-乙醇混合物16μl置于離心管0.2ml內(nèi)，劇烈振蕩，避光靜置15分鐘，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心半小時，將上層液體吸棄。（2）將70%預冷乙醇70μl置于離心管0.2ml內(nèi)，劇烈震蕩，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心15分鐘，把上層液體吸棄。（3）將70%乙醇70μl置于離心管0.2ml內(nèi)，溫和顛倒數(shù)次混勻，按照每分鐘12000r速度離心，在4℃環(huán)境下離心5分鐘，把上層液體吸棄。（4）在室溫下待酒精揮發(fā)干凈后，將Hi-Di Formamide溶解DNA 10μl加入。（5）在PCR以上變性：在94℃環(huán)境下4分鐘，在4℃環(huán)境下4分鐘。上機進行電泳檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件統(tǒng)計工具，對研究中涉及的數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)數(shù)據(jù)以百分比形式表示。

2 結果

2.1 經(jīng)ETV治療的相應突變位點 經(jīng)ETV治療的患者中，共發(fā)生突變類型2種，其中最為常見的當屬rtT184A/G/I/S（n=5，構成比=62.50%），其次為RtS202G/I（n=3，構成比=37.50），均為單獨突變。

2.2 經(jīng)ADV治療的相應突變位點 經(jīng)ADV治療的患者中，共發(fā)生突變類型3種，其中最為常見的當屬rtA181V/T/S（n=8，構成比=12.12%），其次為rtV214A（n=10，構成比=15.15%），然后為rtN236T（n=48，構成比=72.73%）。

2.3 經(jīng)LAM治療的相應突變位點 經(jīng)LAM治療的患者中，共發(fā)生突變類型4種，其中最為常見的當屬rtV207I/L/G（n=61，構成比=47.66%）。在聯(lián)合突變中，rtLI80M+M204V（n=34，構成比=26.56%）的突變率顯著高于rtLI80M+M204I（n=21，構成比=16.41%）、rtM204I（n=12，構成比=9.38%）。

2.4 經(jīng)LdT治療的相應突變位點 經(jīng)LdT治療的患者中，共發(fā)生突變類型2種，其中最為常見的當屬rt M204I（n=3，構成比=60.00），其次為rtLI80M+M204I（n=2，構成比=40.00%）。

3 討論

核苷類藥物是目前臨床治療慢性HBV感染的常用藥，能對病毒起到一定的抑制作用，但用藥時間過長易致NA耐藥。本研究，在拉米夫定中，M204V/I是主要耐藥突變，能使病毒對拉米夫定的敏感性有效降低，其余則表示為代償變異，在一定程度上能使M204V/I變異病毒的復制能力恢復;N236T為阿德福韋主要耐藥突變;T184A/G/I/S為恩替卡韋的主要耐藥突變，M204I為替比夫定的主要耐藥突變。阿德福韋突變屬于二次打擊模式，其突變的構建在拉米夫定耐藥變異的基礎上。拉米夫定和替比夫定均為L-構型的核苷類抗病毒藥物，相比拉米夫定其耐藥率相對偏低[1]。拉米夫定和替比夫定的耐藥位點相似，為逆轉錄酶 C 區(qū)的 rt M204I。所以，LAM耐藥者會出現(xiàn)對LdT的高度交叉耐藥，在換藥時，盡量不實施L-構型核苷類抗病毒藥物，建議選用無環(huán)核苷酸類藥物[2]。

總之，多樣化為核苷類四五耐藥株的氨基酸突變特點，根據(jù)基因型耐藥檢測結果，待抗病毒失敗后對藥物給予及時更換。

參考文獻

[1] 顏悅蓉，馮繼紅.替諾福韋酯治療核苷酸類藥物耐藥慢性乙型肝炎患者的研究進展.臨床肝膽病雜志，2016，32（11）：2182-2185.

[2] 曹輝，張瑋. 核苷類藥物治療慢性乙型肝炎患者影響HBeAg血清轉換的免疫學因素研究進展.實用肝臟病雜志，2017，20（3）：372-376.