ILK調控PLK1的表達對膀胱癌細胞惡性生物學行為的影響

高 娟,董兵衛,李 卓,王云杰,張渭波*

(1西安醫學院第一附屬醫院檢驗科,西安 710077;2咸陽市中心醫院病理科;*通訊作者,E-mail:15091068711@163.com)

整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶。作為一種整合素和細胞質生長因子受體的效應分子,ILK能通過調節下游靶蛋白的表達,如NF-κB通路[1],基質金屬蛋白酶9[2]等,參與惡性腫瘤細胞的粘連、生長、發展和血管生成[3]等過程,在惡性腫瘤的凋亡、侵襲和遷移中發揮著至關重要的作用。前期研究發現[4],高表達ILK能促進膀胱癌細胞增殖和克隆形成,并且在抗癌藥物多西紫杉醇的作用下,膀胱癌細胞的凋亡減少,侵襲增加,同時,增強活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表達水平。PLK1(polo-like kinase 1)是細胞有絲分裂關鍵的調控因子,參與調控多種生物學功能,包括細胞周期和細胞因子分泌等,其在啟動、維持和有絲分裂過程中發揮重要的作用。研究表明,PLK1在黑色素瘤、皮膚梅克爾細胞癌、胰腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達[5-8],并且PLK1的表達水平與某些癌癥的預后密切相關。通過各種措施抑制PLK1表達后可以顯著減少細胞增殖,促進腫瘤凋亡[5]。目前關于ILK和PLK1在膀胱癌發生、發展中的相互作用的研究較少。因此,本研究利用特異性siRNA處理降低了高表達ILK的膀胱癌5637/ILK細胞中PLK1的表達含量,探討ILK調控PLK1的表達對膀胱癌細胞惡性生物學行為的影響,旨在為膀胱癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、細胞和試劑

T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶、逆轉錄試劑盒、DNA marker DL600、DL2000及DL15000均購自寶生物工程(大連)有限公司;去內毒素質粒提取純化試劑盒購自Omega公司(美國);脂質體Lipofectamine 2000和Trizol試劑購自Invitrogen公司(美國);ILK過表達和針對5637/ILK細胞的PLK1 siRNA質粒,人膀胱癌5637細胞和DH5α均由西安醫學院第一附屬醫院中心實驗室保存。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒均購自上海生博醫學生物工程科技有限公司;ILK抗體購自Santa cruz公司(美國);PLK1抗體購自博奧森公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液,于37 ℃,5%CO2飽和濕度孵育箱中常規培養5637細胞,待細胞80%以上融合時進行傳代。取對數生長期的細胞,按2×105個/孔接種至6孔板中,待細胞80%左右融合時,用脂質體Lipofectamine 2000將ILK過表達質粒轉染5637細胞,并命名為5637/ILK組,同時,設轉染空質粒的5637細胞作為陰性對照,并命名為5637/NC組,運用Western blot分別檢測5637/ILK和5637/NC組中ILK的表達。常規傳代培養,待細胞80%左右融合時將低表達PLK1的PLK1 siRNA質粒轉染5637/ILK細胞,同時設5637/ILK細胞為陰性對照,并將實驗分為5637/ILK+PLK1 siRNA組和5637/ILK組。以1.6 mg/ml的G418篩選2周后,更換含0.8 mg/ml G418的培養基維持培養,4周后獲得穩定表達細胞株。

1.2.2 Western blot檢測ILK和PLK1基因的蛋白表達 提取穩定轉染的各組細胞總蛋白,經SDS-PAGE分離后,電轉移至PVDF膜上,采用5%脫脂奶粉封閉2 h;分別加入鼠抗人ILK抗體(1 ∶300稀釋)、兔抗人PLK1抗體(1 ∶750稀釋),兔抗人β-actin抗體(1 ∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜;分別加入HRP標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG(1 ∶2 000稀釋),37 ℃孵育1 h;用增強化學發光顯色系統顯色,再用Quantity one軟件定量,以ILK/β-actin表示ILK蛋白的相對表達量,以PLK1/β-actin表示PLK1蛋白的相對表達量,實驗重復3次。計算ILK蛋白的增高率[=(ILK蛋白相對表達量5637/ILK組/ILK蛋白相對表達量5637/NC組-1)×100%];計算PLK1蛋白的抑制率[=(1-PLK1蛋白相對表達量5637/ILK+PLK1 siRNA組/PLK1蛋白相對表達量5637/ILK組)×100%]。

1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 取對數生長期的各組穩定轉染細胞,以每孔2×105細胞接種于放有蓋玻片的6孔培養板中,待細胞生長至匯合度80%左右,PBS洗3次;4%多聚甲醛固定0.5-1 h;滴加0.1%Triton×100,冰上孵育2 min;每個樣品滴加50 μl TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min,PBS洗3次;甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照,實驗重復3次。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期的各組穩定轉染細胞,接種于6孔細胞培養板中,待密度達到85%時,用10 μl的槍頭在板底部劃痕,更換無血清培養基。常規培養24 h后,95%乙醇固定,Gimesa染色10 min,顯微鏡下觀察傷口愈合情況并拍照,計算細胞相對遷移能力(=0 h時劃痕距離-24 h時劃痕距離),實驗重復3次。

1.2.5 ROS水平檢測 利用活性氧檢測試劑盒檢測細胞中ROS水平。提取待測細胞,在PBS緩沖液中重懸至106個/ml,加入2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針,使細胞與DCFH-DA探針結合。避光37 ℃作用30 min,每隔3-5 min顛倒混勻一次;離心洗滌,重復此步驟3次以去除殘留的DCFH-DA,重懸過篩后即可用流式細胞儀檢測細胞中ROS水平,實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ILK基因的蛋白表達

Western blot結果顯示,5637/ILK組ILK蛋白表達水平較5637/NC組明顯增高,增高率為(72.36±1.58)%。且差異具有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

圖1 Western blot檢測5637/NC組和5637/ILK組中ILK基因的蛋白表達水平Figure 1 ILK protein expression in 5637/NC group and 5637/ILK group by Western blot

2.2 PLK1基因的蛋白表達

Western blot結果顯示,PLK1基因的蛋白表達在5637/ILK+PLK1 siRNA組明顯低于5637/ILK組(P<0.05,見圖2),抑制率為(68.93±2.13)%。

圖2 Western blot檢測5637/ILK組和5637/ILK+PLK1 siRNA組中PLK1基因的蛋白表達水平Figure 2 PLK1 protein expression in 5637/ILK group and 5637/ILK+PLK1siRNA group by Western blot

2.3 各組細胞凋亡分析

TUNEL檢測結果顯示,5637/ILK+PLK1 siRNA組細胞出現大量帶有熒光的細胞(即凋亡細胞),而5637/ILK組僅有少量凋亡細胞出現(見圖3)。細胞凋亡半定量結果顯示,5637/ILK+PLK1siRNA組細胞的凋亡率與5637/ILK組相比顯著增加(66.38%±0.73%vs18.65%±1.26%),差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

2.4 細胞遷移能力分析

劃痕實驗結果顯示,5637/ILK+PLK1 siRNA組細胞在24 h內遷移距離小于5637/ILK組(見圖4),通過計算得出5637/ILK+PLK1 siRNA組細胞的遷移距離為(953.73±95.24)μm,而5637/ILK組細胞的遷移距離為(1 771.47±92.86)μm,結果表明siRNA PLK1可以促使5637/ILK細胞的遷移能力顯著下降。

與5637/ILK組相比,*P<0.05圖3 TUNEL檢測5637/ILK+PLK1 siRNA和5637/ILK組細胞凋亡 (×200)Figure 3 Apoptosis in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group by TUNEL (×200)

圖4 細胞劃痕實驗檢測5637/ILK+PLK1siRNA和5637/ILK組細胞的遷移能力 (×200)Figure 4 Migration capability in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group detected by cell scratch test (×200)

2.5 ROS水平比較

ROS檢測結果顯示,5637/ILK+PLK1 siRNA組細胞ROS熒光強度顯著低于5637/ILK組,差異具有統計學意義(t=11.62,P<0.05,見圖5)。

與5637/ILK組細胞相比,*P<0.05圖5 細胞活性氧檢測試劑盒檢測5637/ILK+PLK1siRNA和5637/ILK組ROS水平Figure 5 ROS levels in 5637/ILK+PLK1 siRNA group and 5637/ILK group detected by cell active oxygen detection kit

3 討論

從全世界的惡性腫瘤發病趨勢來看,膀胱癌高居惡性腫瘤發病率的第10位,在男性惡性腫瘤中排第6位[9]。在中國,膀胱癌是發病率最高的男性惡性腫瘤之一,是發病率最高的泌尿系統腫瘤[10]。

PLK1作為絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一,在前列腺癌[11]、神經母細胞瘤細胞[12]、急性髓性白血病[13]和宮頸癌[14]等多種惡性腫瘤中高表達,其在啟動、維持和完成有絲分裂的過程中起著重要的作用,并且與生存預后關系密切,抑制PLK1表達可以通過干擾有絲分裂的多個階段導致腫瘤細胞死亡,PLK1有望成為癌癥治療的潛在目標,PLK1特異性抑制劑BI2536已被應用于部分癌癥的二期臨床治療試驗[15]。有研究表明,膀胱尿路上皮癌和高侵襲性膀胱T24細胞中的PLK1表達明顯高于膀胱正常組織和淺表膀胱BIU-87細胞。在增加PLK1抑制劑(scytonemin)濃度后,腫瘤細胞不僅增殖和侵襲活性明顯降低,而且發生G2/M期阻滯。PLK1表達狀態與重要的組織病理學特征(分級和分期)以及膀胱尿路上皮癌的復發和轉移密切相關[16]。在裸鼠模型中使用PLK1抑制劑RO3280能抑制膀胱癌細胞生長和細胞周期進程,阻滯膀胱癌異種移植物生長[17]。本研究結果揭示,抑制PLK1的表達,可使過表達ILK的膀胱癌5637/ILK細胞的凋亡明顯增加,遷移能力顯著降低。

ROS是一種具有活性氧功能基團的化合物,其主要的產生場所是在細胞氧化系統中,主要包含氧自由基、過氧化物和激發態氧等,在病理狀況下,大量的ROS對細胞的脂質、蛋白質以及DNA造成影響,導致細胞損傷[18]。PLK1是參與調控腫瘤內環境氧化應激狀態的關鍵分子,例如,PLK1在去勢抵抗性前列腺癌中異常高表達,它是氧化應激誘導的PI3K/AKT/mTOR通路激活的先決條件;類似的,PLK1可幫助急性B淋巴細胞性白血病細胞克服SYK酪氨酸激酶介導的氧化應激抵抗狀態。我們前期研究發現,ILK的異常升高顯著提升細胞內氧化應激狀態[4]。本研究利用特異性siRNA處理降低了高表達ILK的膀胱癌5637/ILK細胞中PLK1的表達含量,結果發現膀胱癌細胞的氧化應激狀態明顯降低,揭示ILK可能通過直接調控PLK1的表達水平來干預膀胱癌細胞的氧化應激狀態,進而促進膀胱癌細胞惡性表型的進展。

綜上所述,下調PLK1的表達水平可明顯逆轉由于ILK過表達導致的膀胱癌細胞凋亡減少、遷移能力增加和氧化應激狀態的升高,這3個功能學上的檢測顯示,ILK過表達所誘導的促癌效應很可能是通過對PLK1的激活作用來實現的。