氯胺酮通過(guò)增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞KAT6B基因表達(dá)提高抗氧化應(yīng)激水平

劉 行,陳嘉鑫,馮建國(guó),賈 靜,王曉斌

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,瀘州 646000;*通訊作者,E-mail:wangxiaobin67@163.com)

生理情況下,神經(jīng)系統(tǒng)的正常氧化應(yīng)激水平對(duì)維持生理功能具有重要作用,氧化應(yīng)激失衡將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,引起抑郁癥、阿爾茲海默癥等疾病[1,2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,在神經(jīng)系統(tǒng)中參與維持氧化應(yīng)激穩(wěn)定[3],其功能的改變將導(dǎo)致抑郁癥等疾病的發(fā)生[4]。氯胺酮是一種常用的麻醉藥物,可以增加抗氧化應(yīng)激能力[5],在臨床麻醉、鎮(zhèn)痛及快速抗抑郁領(lǐng)域有重要作用[6,7],但是其在星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有抗氧化應(yīng)激的作用及其作用機(jī)制不清楚。本研究檢測(cè)氯胺酮對(duì)與氧化應(yīng)激有關(guān)的蛋白乙酰化、KAT6B以及經(jīng)典氧化應(yīng)激通路Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)等的作用,以闡釋氯胺酮提高星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒及總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶消化液及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司;β-actin、Nrf2抗體、羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司;KAT6B購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Western blot乙酰化抗體購(gòu)自中國(guó)景杰生物科技公司;免疫熒光乙酰化抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;TRNzol總RNA提取液、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)購(gòu)自中國(guó)天根生化公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;RT-qPCR引物購(gòu)自中國(guó)深圳華大基因公司;KAT6B siRNA和空白對(duì)照片段購(gòu)自中國(guó)吉瑪制藥公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人星形膠質(zhì)細(xì)胞株HA1800購(gòu)自武漢博士德生物公司,培養(yǎng)條件為高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg鏈霉素,37 ℃和5%CO2。

1.3 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力測(cè)定

HA1800細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L氯胺酮處理12 h,細(xì)胞刮掛取細(xì)胞,于4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,采用比色法測(cè)定GSH-Px活力,WST-1法測(cè)定T-SOD活力,鉬酸胺法測(cè)定CAT活力。

1.4 Western blot檢測(cè)Nrf2、乙酰化及KAT6B蛋白表達(dá)

50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞3,6,12,24 h,刮取細(xì)胞,用裂解液RIPA于冰上裂解30 min,在4 ℃下12 000 r/min離心15 min后取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度,蛋白樣品加入上樣緩沖液,100 ℃蛋白變性,行SDS-PAGE電泳。以每孔20 μg上樣,蛋白電泳結(jié)束后,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白至NC膜,于含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h,加入一抗(稀釋比例分別為:β-actin 1 ∶5 000,Nrf2 1 ∶1 000,KAT6B 1 ∶1 000,乙酰化1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后室溫孵育相應(yīng)二抗(稀釋比例分別為:羊抗鼠二抗1 ∶2 500,羊抗兔二抗1 ∶5 000)1 h,ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白條帶顯影。將所得蛋白條帶用Image J進(jìn)行灰度值數(shù)據(jù)分析。

1.5 免疫熒光染色檢測(cè)乙酰化及Nrf2蛋白表達(dá)

免疫熒光染色用于檢測(cè)乙酰化的表達(dá)情況及Nrf2蛋白的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞經(jīng)氯胺酮處理12 h,經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min,0.2% Triton X-100破膜處理15 min,1%BSA室溫封閉30 min,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗3次后室溫避光孵育二抗1 h,DAPI染核5 min,經(jīng)PBS洗3次后加入抗猝滅劑,熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)KAT6B mRNA及circRNA表達(dá)

經(jīng)氯胺酮(50 μmol/L)處理12 h的HA1800細(xì)胞,采用TRNzol試劑提取總RNA,FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(QIAGEN)試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性600 s;95 ℃ 15 s變性,60 ℃ 40 s退火,95℃ 10 s延伸,重復(fù)40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃條件下延時(shí)5 min。KAT6B mRNA的引物序列:正義5′-ACAACAACAGGGGGACACAA-3′,反義5′-CCGCATGGCAGATTCTCTCT-3′;KAT6B circRNA的引物序列:正義5′-TGGGAGGTTACTGAAAGACGG-3′,反義5′-AGGCAATGTTGATGGTTGTCTTA-3′;以GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列:正義5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反義5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行KAT6B mRNA及circRNA含量的相對(duì)定量計(jì)算。

1.7 siRNA抑制KAT6B mRNA的表達(dá)

HA1800細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)至融合度達(dá)到70%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,更換Opti-MEM培養(yǎng)基,加入siRNA9.4 μl,混勻,加入Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑3.75 μl,加入混合好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,搖勻,常溫下作用15 min,繼續(xù)培養(yǎng),4 h后更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h,使用Western blot檢測(cè)干擾效果,使用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。共設(shè)4組:對(duì)照組(siRNA-NC組,即NC組)、氯胺酮處理組(siRNA-NC+50 μmol/L氯胺酮處理12 h組,即NC+K組)、KAT6B基因轉(zhuǎn)染組(siRNA-KAT6B組,即S組)和KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組(siRNA-KAT6B+50 μmol/L氯胺酮處理12 h組,即S+K組)。處理后分別按照方法1.3和1.4步驟測(cè)定Nrf2和乙酰化蛋白的表達(dá)情況,并測(cè)定T-SOD和CAT活力的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

HA1800細(xì)胞經(jīng)過(guò)50 μmol/L氯胺酮處理12 h后,GSH-Px(P=0.022 3)、T-SOD(P=0.020 0)和CAT(P=0.045 3)活力明顯升高(見(jiàn)圖1)。

2.2 氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2、KAT6B及乙酰化表達(dá)水平的影響

50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞后,結(jié)果顯示Nrf2、KAT6B和乙酰化水平均顯著提高(Nrf2:F(4,10)=93.53,P<0.000 1;KAT6B:F(4,10)=43.79,P<0.000 1;乙酰化:F(4,10)=40.51,P<0.000 1,見(jiàn)圖2)。免疫熒光結(jié)果分析也發(fā)現(xiàn)與0 μmol/L比較,50 μmol/L氯胺酮處理星形膠質(zhì)細(xì)胞12 h,乙酰化表達(dá)明顯增加(P=0.032 0,見(jiàn)圖3);使用50 μmol/L氯胺酮處理HA1800細(xì)胞12 h,Nrf2蛋白聚集于細(xì)胞核周圍(見(jiàn)圖4),提示該蛋白出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

與0 μmol/L比較,*P<0.05圖1 氯胺酮對(duì)HA800細(xì)胞抗氧化應(yīng)激酶活力的影響Figure 1 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities of HA1800 cells

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 氯胺酮對(duì)HA1800細(xì)胞KAT6B mRNA及circRNA含量的影響Figure 5 Effects of ketamine treatment on KAT6B mRNA and circRNA in HA1800 cells.

與0 h比較,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1圖2 50 μmol/L氯胺酮作用不同時(shí)間對(duì)HA1800細(xì)胞Nrf2、KAT6B及乙酰化蛋白表達(dá)的影響Figure 2 The effects of 50 μmol/L ketamine on the expression of Nrf2, KAT6B and acetylation protein inHA1800 cells

圖3 免疫熒光染色顯示氯胺酮對(duì)HA1800細(xì)胞乙酰化表達(dá)的影響Figure 3 Effect of ketamine on the expression of acetylation inHA1800 cells by immunofluorescence

圖4 氯胺酮調(diào)節(jié)Nrf2蛋白在HA1800細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Figure 4 Eeffect of ketamine on subcellular location of Nrf2 in HA1800 cells

2.3 氯胺酮對(duì)HA1800細(xì)胞內(nèi)KAT6B mRNA及circRNA含量的影響

50 μmol/L氯胺酮處理12 h,HA1800細(xì)胞內(nèi)KAT6B mRNA含量明顯增加(P=0.002),KAT6B circRNA含量明顯降低(P=0.016 4,見(jiàn)圖5)。

2.4 沉默KAT6B基因降低氯胺酮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力的作用

抑制KAT6B基因表達(dá)(F(3,8)=135.62,P<0.000 1)之后,HA1800細(xì)胞內(nèi)Nrf2(F(3,8)=51.78,P<0.000 1);乙酰化(F(3,8)=102.52,P<0.000 1)的含量及抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶(T-SOD:F(3,8)=195.62,P<0.000 1;CAT:F(3,8)=106.49,P<0.000 1)的活力明顯變化(見(jiàn)圖6,7)。與NC+K組比較,S+K組Nrf2(P<0.000 1)、乙酰化(P=0.033)的含量及T-SOD(P=0.005 5)、CAT(P<0.000 1)的活力均明顯降低(見(jiàn)圖6,7)。

NC組:siRNA-NC組;NC+K組:氯胺酮處理組;S組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染組;S+K組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組;與NC組比較,***P<0.001,****P<0.000 1;與NC+K組比較,#P<0.05,####P<0.000 1圖6 氯胺酮對(duì)KAT6B基因沉默后HA1800細(xì)胞KAT6B、Nrf2及乙酰化蛋白的影響Figure 6 Effects of ketamine treatment on KAT6B, Nrf2 and acetylation protein expression after silencing KAT6B gene in HA1800 cells

NC組:siRNA-NC組;NC+K組:氯胺酮處理組;S組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染組;S+K組:KAT6B基因轉(zhuǎn)染+氯胺酮處理組;與NC組比較,**P<0.01,****P<0.000 1;與NC+K組比較,##P<0.01,####P<0.000 1圖7 氯胺酮對(duì)KAT6B基因沉默后HA1800細(xì)胞抗氧化應(yīng)激酶活力的影響Figure 7 Effects of ketamine treatment on antioxidant activities after KAT6B gene silencing in HA1800 cells

3 討論

目前臨床常用的抗抑郁藥物存在起效慢、抗抑郁效果不穩(wěn)定等不足,迫切需要新的快速起效的抗抑郁藥物[8],氯胺酮因其快速而明顯的抗抑郁作用受到越來(lái)越多的關(guān)注[9]。但具體通過(guò)什么途徑發(fā)揮抗抑郁作用仍不清楚,闡明相關(guān)信號(hào)通路,對(duì)于開(kāi)發(fā)新的快速起效的抗抑郁新藥具有重要指導(dǎo)作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和相關(guān)功能具有密切聯(lián)系,可通過(guò)離子通道、能量代謝、神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)支持等途徑參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展[10,11]。胡海嵐等[12]的研究表明,抑郁癥大鼠模型的外側(cè)僵核的星形膠質(zhì)細(xì)胞鉀通道(Kir4.1)被上調(diào),可能作為治療抑郁癥的靶點(diǎn)。此外,Cotter等[11]的研究顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞供給能量不足時(shí),會(huì)減少神經(jīng)細(xì)胞樹突分枝,增加神經(jīng)元的易損性及對(duì)抑郁癥的易感性。此外,氧化應(yīng)激水平增加對(duì)抑郁癥的發(fā)生有促進(jìn)作用[13]。在抑郁大鼠模型體內(nèi)SOD、CAT活力降低,且在使用S-氯胺酮之后,SOD、CAT的活力增加[5]。并且抑郁癥患者在接受抗抑郁藥物治療前,血清內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加[14]。研究結(jié)果表明50 μmol/L氯胺酮明顯增加了人星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶GSH-Px、SOD和CAT的活力,證實(shí)氯胺酮可增加抗氧化應(yīng)激酶的活力,但具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

已有研究證實(shí),Nrf2在阿爾茨海默氏癥、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病中被激活,而在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中,Nrf2活性被抑制,只有培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Nrf2激活劑產(chǎn)生反應(yīng)[15],提示Nrf2與星形膠質(zhì)細(xì)胞具有密切的聯(lián)系。Nrf2蛋白可結(jié)合DNA上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件,是機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平的重要調(diào)節(jié)因子[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氯胺酮處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后,抗氧化應(yīng)激酶的活力和Nrf2蛋白的表達(dá)增加,但氯胺酮引起Nrf2蛋白表達(dá)增加的具體機(jī)制尚不明確。

研究表明,乙酰化水平和Nrf2表達(dá)密切相關(guān)[17]。通過(guò)p300/CBP途徑使Nrf2的乙酰化水平增加能夠促進(jìn)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中Nrf2序列的啟動(dòng)子結(jié)合,從而誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平增加[18]。此外,組蛋白去乙酰化抑制劑丙戊酸可以通過(guò)恢復(fù)組蛋白乙酰化水平,改善Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御機(jī)制破壞所導(dǎo)致的抑郁癥[17]。本研究結(jié)果表明氯胺酮可明顯提高星形膠質(zhì)細(xì)胞乙酰化水平。但氯胺酮通過(guò)什么途徑影響乙酰化水平還不清楚。

KAT6B基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種乙酰基轉(zhuǎn)移酶,其表達(dá)水平可調(diào)節(jié)機(jī)體乙酰化水平。最近研究顯示,環(huán)狀RNA的形成機(jī)制主要為RNA反向剪切,在前體RNA形成環(huán)狀RNA的過(guò)程中,可導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的線狀RNA減少,即環(huán)狀RNA與線狀RNA的產(chǎn)生存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[19]。前期研究結(jié)果表明[20],氯胺酮處理后,大鼠海馬組織內(nèi)rno-circRNA-005442表達(dá)降低,且該環(huán)狀RNA與KAT6B基因同源。檢測(cè)氯胺酮處理后KAT6B基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),線狀RNA含量明顯降低,環(huán)狀RNA含量明顯增加,且沉默KAT6B基因的表達(dá)后,Nrf2、乙酰化蛋白表達(dá)降低,T-SOD和CAT活性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)氯胺酮致KAT6B表達(dá)增加與氯胺酮減少環(huán)狀KAT6B形成相關(guān)。

綜上所述,氯胺酮可通過(guò)調(diào)節(jié)KAT6B基因的表達(dá),提高乙酰化水平,促進(jìn)Nrf2表達(dá),增加抗氧化應(yīng)激酶的活力,最終提高星形膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。