新疆肥胖人群尿液代謝輪廓分析

阿麗葉古麗·艾皮熱，克力木·阿不都熱依木，凱賽爾·艾則孜，李贊林2,，艾克拜爾·艾力2,

(1.新疆維吾爾自治區人民醫院臨床醫學研究中心，新疆 烏魯木齊，830001；2.新疆維吾爾自治區人民醫院普外微創研究所;3.新疆維吾爾自治區人民醫院微創、疝和腹壁外科)

肥胖癥是體內熱量攝入長期超過消耗量導致體內脂肪堆積過多或/和分布異常的復雜慢性代謝性疾病，與環境(包括社會與文化)、遺傳、生理、代謝、飲食、行為及心理等多種因素有關，可引發糖尿病、高脂血癥、冠心病、高血壓、脂肪肝、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、慢性腎功損害、內分泌功能紊亂等多種嚴重代謝障礙性并發癥與疾病，從而嚴重威脅患者身心健康，甚至影響壽命。超重及肥胖者隨著BMI的增加，肥胖相關并發癥發生風險增加，而且死亡率隨體重增加呈幾何級數升高。隨著社會經濟的發展及生活水平的提高，不論發達國家抑或發展中國家，肥胖癥發病率正在逐年上升，已成為全球蔓延速度最快、最嚴重的公共衛生問題之一[1]。在美國，約1/3人口為超重，1/3人口為肥胖，肥胖僅次于過度吸煙排在可預防致死因素的第二位，每年直接或間接花在肥胖治療上的費用超過1千億美元[2]。肥胖癥已被世界衛生組織認定為影響人類健康的五大危險因素之一。在國內情況同樣不容樂觀，中國疾病預防控制中心進行的中國慢性病調查顯示，2007年與2010年中國成年人(18～64歲)超重的患病率分別為26.6%與30.6%，肥胖的患病率分別為7.7%與12.1%[3]。因此，如何有效控制體重，控制與減少肥胖及肥胖并發癥的發生，已成為倍受關注的話題。開展與肥胖相關的課題研究也成為了新世紀的迫切任務。新疆是維吾爾族、漢族等多民族聚居地，地理環境與自然生態條件特殊，民族生活風俗習慣與飲食文化獨特，動物高熱量、高脂肪、高蛋白飲食相當普遍，因此在新疆地區肥胖更為高發。Song等的流行病學調查顯示，在新疆維吾爾族人群總肥胖率高達23.57%，男、女性分別為18.12%與29.03%，明顯高于全國平均水平[4]。目前針對新疆地區少數民族肥胖癥的發病機理、生物相關標志物、早期預警系統建立等方面的研究較少。采用疾病代謝組學、蛋白質組學、基因組學等現代科技手段深入研究新疆少數民族肥胖癥高發原因，具有重要的科學意義與實際應用價值。

代謝組學是系統生物學的重要組成部分，能對生物流體中的代謝產物與代謝中間物進行定性定量分析，發現由疾病過程引起的代謝異常，幫助人們更好地理解病變過程及機體內物質的代謝途徑，還有助于疾病生物標志物的發現及輔助臨床診斷的目的[5-6]。使用代謝組學技術研究肥胖的發生發展更具備宏觀性、動態性與準確性。從而了解到肥胖及其相關疾病發生、發展過程中代謝物質與特征性蛋白表達的變化規律及其相關性，發現與疾病相關的異常代謝路徑，并闡明與疾病相關的分子機制。但性別、年齡、飲食、生活方式及地域多樣性等生理與環境因素嚴重影響代謝組學結果的可靠性與準確性[7-9]。然而新疆作為多民族地區，民族傳統與飲食文化多種多樣，在進行疾病代謝組學的研究過程中，如不考慮族別因素，會在代謝組學研究結果中引入大量假陽性的結果，嚴重干擾相關研究結果的可靠性?；谝陨显?，本研究采用氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析技術，系統研究新疆主要世居民族之一——維吾爾族健康正常體重、超重與肥胖人群尿液代謝輪廓，觀察新疆維吾爾族正常、超重與肥胖人群尿液樣本中代謝物，并發現與鑒定差異代謝物；進而發現肥胖與正常體重人群相比發生的根本的代謝改變。由于肥胖導致的機體代謝改變也可能是肥胖相關慢性代謝性疾病(代謝綜合征、糖尿病等)形成與發展的原因，因此也可能找到肥胖相關慢性代謝疾病早期的生物標志物，為肥胖及其相關慢性疾病的早期發現與早期防治提供科學依據及新的思路。

1 材料與方法

1.1 標本收集與儲存 研究對象均為2016年1月至2017年12月新疆維吾爾自治區人民醫院體檢中心健康體檢與減重外科中心住院治療的維吾爾族成人作為受試者，20～60歲。按照WHO肥胖分級標準將受試者分為三組，即正常體重組(18.5 kg/m2≤BMI<25 kg/m2)，超重組(25 kg/m2≤BMI<30 kg/m2)與肥胖組(BMI≥30 kg/m2)。為排除混雜因素，剔除惡性腫瘤、急性炎癥、創傷、繼發性肥胖、妊娠、嚴重心肺肝腎器質性疾病、精神病及有減肥手術史、服用對脂代謝有影響藥物的患者。收集空腹晨尿30 mL，于-80℃保存。

1.2 實驗材料 N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(98%)；三甲基氯硅烷、甲氧基胺鹽酸鹽(98%)；吡啶(分析純)，十二酸(色譜純)。

1.3 GC-MS分析樣品前處理 根據文獻報道[10]處理尿樣，取200 μL尿樣加20 μL尿素酶混懸液(相當于100 U尿素酶)，37℃培養箱內孵化1 h，降解尿液中的尿素。加1.7 mL甲醇，10 000 g離心10 min(4℃)。取1.5 mL上清液，用氮吹儀50℃下吹干溶劑。干燥后的樣品中加入100 μL甲苯溶解混勻，再用氮吹儀50℃下吹干20 min干燥。干燥樣品中加入50 μL甲氧胺60℃烤箱中反應2 h。加入7 μL (5 mg/mL)月桂酸對照溶液(內標物)。樣品中快速加入100 μL MSTFA/TCMS (99:1)，60℃烤箱中反應1 h。樣品降溫至常溫，移入GC瓶中待測。實驗用樣品取一定量漩渦混勻，再取混勻后的前處理樣品200 μL，按樣品的制備方法制備。每10個樣品后放一個前處理樣品檢測。180個尿樣需要18個前處理樣品檢測。

1.4 GC-MS分析條件 色譜條件[11]:Agilent HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣(純度：99.999%)，柱流量1.0 mL/min。程序：升溫條件初始柱溫60℃，保留2 min，以10℃/min升溫至280℃，維持10 min。進樣口溫度為280℃，接口溫度280℃，進樣量為 0.2 μL，分流模式：不分流。質譜條件：電離方式EI，碰撞能量為70 ev，離子源溫度230℃，溶劑延遲時間為6.2 min，掃描方式：全掃描：40～600 m/z。

1.5 CG-MS 數據分析 通過安捷倫定性分析軟件Masshunter的Find by Chromatogram Deconvolution功能查找未知化合物，歸類，將原始數據的“.d”格式轉換為“.cef”，對總離子流圖進行特征離子提取，導入MPP軟件(Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional)進行數據預處理，得出的數據矩陣進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，利用SIMCA-P 進行數據分型，利用NIST14質譜數據庫進行比對，確定代謝標記物。

2 結 果

2.1 臨床資料 肥胖組、超重組的BMI、腰圍、舒張壓高于正常組，差異有統計學意義(P<0.001)；肥胖組高密度脂蛋白低于超重組與正常組，差異有統計學意義(P<0.001)；3組患者性別、年齡、收縮壓、血糖、低密度脂蛋白、游離脂肪酸水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者臨床資料的比較

續表1

2.2 GC-MS結果

2.2.1 質量控制 選擇內標物的特征離子峰進行分析，計算特征離子峰的保留時間偏移，峰面積偏差與離子精確質量數漂移。結果顯示，特征峰保留時間偏移<0.1 min，峰面積的RSD<15%，精確質量數漂移值<7 ppm。由此可見，在代謝數據采集過程中，GC-MS系統穩定，所采集數據較為可靠。

2.2.2 PCA分析 從各組數據的PCA分析圖可知，肥胖組、超重組、正常組的尿代謝物得到了較好的分離，且各組內聚合度較好。見圖1、圖2。

2.2.3 MPP分析差異代謝物 MPP軟件分析肥胖組、超重組、正常組所有樣品，共檢測到3 995個化合物，進行組間出現概率>75%過濾篩選后得234個化合物；再進行組內出現概率100%篩選，得到54個化合物。One-Way ANOVA分析，組間進行多重比較，找到P<0.05的差異變量化合物16個。將化合物帶回Masshunter 軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14質譜數據庫對可能的標記物進行鑒定，匹配度大于80%的鑒定結果較為可信。見表2。

表2 差異代謝物鑒別結果

3 討 論

代謝組學從分子水平對代謝途徑中的終端產物進行研究，在發現診斷疾病、評估療效的新標志物及探究制定新的個體化治療方案等方面均存在顯著優勢[12]，在疾病代謝組學研究中，眾多內部與外部因素均影響生物樣本中代謝物的組成與含量，導致代謝組學研究結果存在極大的可變性。飲食習慣、外界壓力、身體健康狀態、參加鍛煉頻率與強度等外部生理條件在動物實驗中可通過嚴格控制，得到最大化的降低或消除這些因素的影響[13-14]，但針對人進行疾病組學研究，此法并不適用，導致相關代謝組學研究結果存在大量不可預測的變量。Lenz等[15]系統研究了英國與瑞典兩個國家健康人群的尿液輪廓，發現由于兩個國家間飲食傾向與文化的不同，人群尿液樣本輪廓存在較大差異，如氧化三甲胺在瑞典健康人群尿液中含量中明顯高于英國健康人群；Dumas等[16]系統考察了日本、芝加哥與中國的健康人群，證實了三個國家健康人群由于飲食、基因及腸道微生物等因素導致尿液輪廓出現差異。表明民族文化與傳統的差異會導致不同族別人群尿液樣本中代謝物的種類與含量存在差異，嚴重干擾相關疾病生物標志物的發現與鑒定。因此在對新疆地區高發病進行研究時，應充分考慮族別對疾病代謝組學研究產生的影響。

尿液中代謝物的波動不僅能反映機體整體代謝的特征，還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現，因此，通過對尿液中存在的差異性代謝產物的檢測可推測人體內的代謝過程。近年，對尿液代謝相關研究的報道較多，更有涉及腎細胞癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌等肥胖相關腫瘤性疾病，以及高血壓、糖尿病、睡眠呼吸暫停癥狀等肥胖相關疾病[17-21]。而且GC-MS聯用技術具備較為完善的質譜數據庫，操作簡便，具有較強的分離分析能力，已得到廣泛應用[22-23]。Gompertz等應用氣譜-質譜聯用分析糖尿病患者尿液，結果發現a-羥基異戊酸、a-酮異戊酸、a-酮異己酸、a-酮b-甲基戊酸、b-羥基丁酸等升高顯著，從而利用這5種有機酸聯合進行糖尿病患者的初始篩查與診斷。Yuan等還分析了28例2型糖尿病青年男性患者的單純性肥胖血液與尿液的代謝組學研究及26例健康人群尿中的有機酸譜，得到4種有機酸為2型糖尿病的標志物，也可對糖尿病患者進行明確診斷。那么使用代謝組學技術研究肥胖的發生發展就更具備宏觀性、動態性與準確性。

本研究中我們通過GC-MS代謝組學技術檢測肥胖、超重及健康對照組維吾爾族人群的尿液樣本，共鑒定出葡萄糖、阿拉伯糖、L-蘇糖酸、2-酮基-L-古龍酸、羥基丙酸、丙氨酸、甘油酸、檸蘋酸、乳糖、尿酸、乙醇酸、赤蘚糖醇、甘氨酸、棕櫚酸單甘油酯、丁酸、纖維二糖等16種差異性代謝產物，其代謝途徑主要涉及糖脂代謝、氨基酸代謝、能量代謝等。

3.1 糖脂代謝 本研究結果表明，在差異代謝物中葡萄糖依然是肥胖患者尿液中變化最為顯著的代謝標志物，作為生物體內新陳代謝不可缺少的重要物質之一，它參與了眾多代謝途徑，包括脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。肥胖患者體內由于存在胰島素抵抗與分泌不足的情況，往往導致糖酵解減慢及血、尿中葡萄糖水平的升高。在與葡萄糖相關的代謝途徑中，雖然糖酵解/糖異生途徑最為重要，但作為重要的功能來源其參與了脂代謝、能量代謝等多種途徑，因此綜合分析才能得到更全面的信息。本研究發現，在超重及肥胖患者的尿液中均存在葡萄糖含量明顯升高的特點，并伴隨著能量代謝標志物及氨基酸代謝物的差異。

3.2 氨基酸代謝 本研究發現在超重及肥胖患者中，有甘氨酸、丙氨酸等氨基酸代謝物存在差異，表明肥胖患者體內發生氨基酸代謝的紊亂。氨基酸代謝差異可能與多種因素有關，如飲食習慣、生活環境等。其不僅是重要的營養物質，更參與了多種神經遞質的功能，如甘氨酸、丙氨酸是抑制性神經遞質，經谷氨酞胺轉變后成為興奮性神經遞質。丙氨酸還是糖代謝與免疫系統的重要氨基酸。

3.3 能量代謝 本研究鑒定出與能量代謝有關的化合物主要有乳酸、丙氨酸。乳酸是糖酵解過程中由葡萄糖無氧降解而成。超重及肥胖患者尿液中的乳酸含量均高于于正常組，表明超重及肥胖患者存在有氧代謝障礙與無氧酵解失衡，出現了能量代謝的紊亂。此外，尿中氨基酸變化多系肝臟葡萄糖糖異生引起的，本研究發現，肥胖患者尿液中甘氨酸含量發生了變化，也可能由肝臟葡萄糖糖異生引起。丙氨酸參與了多種代謝途徑，也是能量來源之一。尿液中丙氨酸含量增加，亦表明能量代謝水平發生了變化。由于影響代謝的因素很多，肝、腎、腦、肌肉、紅細胞等組織器官均參與其中，代謝物的代謝途徑多樣，因此，從整體來看，肥胖癥患者的能量代謝水平降低。在本研究中維吾爾族肥胖患者尿液中丙氨酸含量上升，表明葡萄糖的正常代謝被抑制。

丁酸是一種四碳短鏈天然脂肪酸，而短鏈脂肪酸既是體內重要的能量來源，由腸道微生物對食物中的碳水化合物發酵所產生的，而且它通過相應的受體調節基因表達，通過腸-腦軸調節能量平衡。本研究發現，肥胖患者尿液中丁酸含量發生了一定的下調。此結果與吳水蕓[24]的報道結果一致。赤蘚糖醇是一種糖醇，由酵母菌發酵而成，也存在于一些水果及發酵食品中，幾乎不被人體腸道菌群的細菌消耗；因此過量的赤蘚糖醇在尿液中未經修飾地排出[25]。本研究結果發現，超重及肥胖患者尿液中赤蘚糖醇含量較正常體重組降低，表明超重及肥胖患可能菌群代謝發生了改變。

上述可見，肥胖癥患者體內三大代謝均存在異常，某一代謝途徑的改變引起關聯途徑的變化，從而形成惡性循環，最終造成累及全身的代謝紊亂綜合征。在此后的研究中應重點揭露該代謝產物與肥胖并發癥之間的確切關系，以便為治療與預防肥胖癥及其相關并發癥提供理論依據。