南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞增殖和侵襲轉移的影響①

楊慶偉，梁海鵬，陳小鵬，張志峰，劉延慶

(1.慶陽市人民醫院腫瘤外科，甘肅 慶陽 745000；2.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225001)

南蛇藤(Celastrus orbiculatus)系衛矛科南蛇藤屬植物[1～3]，在我國分布廣泛，長江以南地區多見。南蛇藤含有多種藥理活性成份(萜類、苷類及脂肪類化合物)，具有抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗纖維化和抗生育等作用。近年來，研究發現南蛇藤總萜(主要為二萜和三萜類化合物)對消化道腫瘤表現出很好的抗腫瘤活性，對胃癌和肝癌抗瘤研究多有報道[4～6]。本研究通過南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細胞，觀察其在體外對人食道癌Eca-109細胞增殖、凋亡和侵襲轉移的影響，明確其抗瘤機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

南蛇藤粉碎成粉烘干，95%乙醇加熱回流提取3次，旋轉蒸發儀回收溶劑得到浸膏，拌入硅藻土，真空低溫抽干，再用乙酸乙酯熱水浴加熱回流，過濾，回收得到乙酸乙酯浸膏。其主要成份為南蛇藤總萜(二萜類和三萜類)。二甲基亞砜助溶，其濃度小于0.05%，以無血清培養基配成實驗所需要濃度工作液。

1.2 試劑

DMEM培養基為Gibco公司產品，小牛血清為杭州四季青公司產品，MTT粉劑為Sigma公司產品，PI(碘化丙啶)為上海晶美公司產品。鼠抗人MMP-9單抗和鼠抗人COX-2單抗為北京中杉公司產品，異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗鼠IGg為碧云天生物公司產品，人血管內皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒為博士德生物公司產品。

1.3 儀器

倒置相差顯維鏡為產自日本的Olympus產品，酶標儀為產自芬蘭的Labsystems Dragon產品，流式細胞儀為產自美國BD公司的FACSAria產品， CO2恒溫孵箱為產自美國的REVCO產品，恒溫水浴鍋產自于上海申生科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養：實驗組分別加入濃度分別為10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養基替代。細胞由揚州大學醫學院分子生物研究所提供，常規培養于10%小牛血清、100KU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養基中。于37℃含體積分數為5%CO2的孵箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4.2 MTT試驗： 取對數生長期人食道癌Eca-109細胞，以1×104個/孔接種于96空培養板中，培養過夜，實驗組分別加入濃度分別為10、20、40、80、160μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養24h后，加入MTT工作液(5mg/mL)20μL，繼續培養4h，棄去各孔內液體，每孔加入100uL二甲基亞砜，微波振蕩器振蕩10min后，使細胞內和周圍紫色顆粒充分溶解，室溫放置10min。于全自動酶標儀測定各孔A570nm值，每組重復6復孔，計算腫瘤細胞生長抑制率(IR)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。

選取濃度為40μg/mL的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細胞24、48、72、96h，MTT法測定各孔A570nm值，計算細胞抑制率。對照組用等體積的DMEM培養基替代。

1.4.3 細胞凋亡率測定：人食道癌Eca-109細胞以3×105個/孔接種于六空培養板中，培養過夜，實驗組分別加入濃度分別為10、20、40、80μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養作用24h、48h后，離心去上清，收集細胞，轉移到1.5mL的EP管中，加入10uL PI,混勻后于室溫下避光10min，流式細胞儀測定凋亡率。

1.4.4 對基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白和環氧化酶-2(COX-2)蛋白表達的影響。取食道癌Eca-109細胞接種于50mL細胞瓶中，培養過夜，實驗組分別加入濃度分別為5、10、20、40μg/mL的南蛇藤總萜，對照組用等體積的DMEM培養基替代。在37℃、5% CO2的孵箱中培養作用24h后，收集細胞，轉移到1.5mL的EP管中，加入含有0.1%多聚甲醛的PBS固定，后加入含有0.1% Triton X-100的PBS,分別加入鼠抗人MMP-9單抗和鼠抗人環氧化酶-2單抗，常溫下留置30min后加入羊抗鼠FTTC-IgG,靜置后上流式細胞儀檢測。FI(Fluresence Index ,FI)代表熒光指數，具體公式如下FI=檢測管細胞平均熒光強度/對照管細胞平均熒光強度。對照管FI=1，如FI>1.為陰性表達，FI<1.為陽性表達。

1.4.5 對血管內皮生長因子(VEGF)測定。取人食道癌Eca-109細胞接種于50mL細胞瓶中，在在37℃、5% CO2的孵箱中培養作用24h后，實驗組分別加入濃度分別為5、10、20、40μg/mL的南蛇藤總萜繼續培養48h，對照組用等體積的DMEM培養基替代，后分別吸取培養上清留置待用。具體操作按照ELISA試劑盒要求執行。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞增殖的抑制作用

不同濃度的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細胞24h后，MTT結果顯示，南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞有抑制作用，當藥物濃度為160μg∕mL時，最大抑制率為44.69%，存在量效關系，見表1。選取濃度為南蛇藤總萜40μg∕mL作用于人食道癌Eca-109細胞，分別孵育24h、48h、72h、96h后，結果顯示藥物作用96后，南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞最大抑制率可達40.18%，南蛇藤總萜抑瘤效果存在時間依賴性，見表2。

2.2 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞凋亡的影響

選取南蛇藤總萜10、20、40、80μg/mL各不同濃度作用于人食道癌Eca-109細胞，分別孵育24h、48h后，通過流式細胞法檢測南蛇藤總萜誘導人食道癌Eca-109細胞的凋亡率。結果顯示，隨著南蛇藤總萜濃度的增加，人食道癌Eca-109細胞的凋亡率在逐步升高，24h作用后最大凋亡率30.64%，48h作用后最大凋亡率37.31%，南蛇藤總萜可以誘導人食道癌Eca-109細胞凋亡，呈濃度和時間依賴關系。與對照組比較，存在差異性。見表3。

表1 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞 增殖的抑制作用

表2 不同作用時間南蛇藤總萜(40μg∕mL)對人食道癌 Eca-109細胞增殖的抑制作用

表3 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞 凋亡的影響

2.3 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞MMP-9和COX-2的影響

選取濃度分別為5、10、20、40μg/mL南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細胞24h后，通過流式細胞儀法檢測MMP-9和COX-2 FI值的變化。結果顯示，隨著藥物濃度的增大，MMP-9和COX-2的FI值在逐步減小，存在量效關系，與對照組比較存在差異性。當南蛇藤總萜40μg/mL時MMP-9 的FI值(0.60±0.02)，當南蛇藤總萜40μg/mL時COX-2的FI值(0.51±0.05), 說明南蛇藤總萜能夠下調MMP-9和COX-2蛋白的表達,尤其在下調COX-2蛋白的表達表現出更好的優越性。見表4。

表4 南蛇藤總萜對人食道癌MMP-9、COX-2、VEGF的影響

2.4 南蛇藤總萜對人食道癌Eca-109細胞VEGF的影響

不同濃度的南蛇藤總萜作用于人食道癌Eca-109細胞48h后，通過ELISA法檢測VEGF的變化，結果顯示，南蛇藤總萜能夠下調VEFG的表達，存在量效關系。當南蛇藤總萜濃度為40μg/mL時，VEGF的含量降至(288.31±15.18)pg/mL，與對照組(490.62±20.73)pg/mL存在差異性。見表4。

3 討論

全球食管癌發病率居世界惡性腫瘤第8位，在36種癌癥死亡例數中排在第6位，是世界上最常見和最致命的癌癥之一[7,8]。我國是食管癌高發國家[9]，發病率排在全球前5，雖然我國多年來非常重視食管癌的診療工作，但90%確診的食管癌患者為中晚期，因而藥物的治療在食管癌的綜合治療中扮演著重要角色。南蛇藤總萜目前對胃癌和肝癌抑瘤報道較多，表現出很好的抗腫瘤活性。本研究結果顯示南蛇藤總萜能夠抑制人食道癌Eca 109細胞的增殖，誘導人食道癌Eca細胞凋亡，其抑瘤效果存在劑量和時間依賴性。COX-2是體內一種分解花生四烯酸產生前列腺素過程的限速酶，它以促進多種途徑參與消化道腫瘤的發生、發展和轉移，不僅在多種腫瘤細胞中表達，而且在消化道腫瘤細胞內多有高表達[10]。COX-2的高表達可改變與細胞增殖和凋亡有關的基因表達，從而促進腫瘤的形成和發生。有研究顯示[11]，下調COX-2蛋白的表達，可以抑制VEGF和MMP-9的生成，抑制腫瘤的侵襲和轉移。實驗結果顯示，南蛇藤總萜能夠誘導人食道癌Eca109細胞凋亡，下調COX-2、VEGF和-MMP-9的表達，我們是否可以認為南蛇藤總萜下調COX-2蛋白的表達，導致了其下游分子VEGF和MMP-9出現低表達,同時南蛇藤總萜對VEGF和MMP-9亦有抑制作用，抑制了腫瘤的侵襲和轉移。可以認為南蛇藤總萜對人食道癌Eca109細胞增殖的抑制和凋亡的影響，與南蛇藤總萜下調"COX-2-VEGF-MMP-9"信號通路密切相關。當然，腫瘤的發生是一個多因素、多基因、多步驟協同作用的復雜過程，其過程可能涉及多個癌基因和抑癌基因的突變，以及各種酶類物質的改變，其抗瘤機制還有待于進一步的研究。