蛇床子提取物對小鼠陰道菌群影響的研究①

孫盛梅,溫達靜,趙東旭,周海瑞,于春楊,郭 靖,董子鈺

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

健康女性陰道存在多種微生物，與人體內分泌調節和免疫機制、陰道內酸堿度處于動態平衡狀態。在正常女性陰道微生態中乳酸桿菌占據優勢地位，大量研究表明，乳酸桿菌分解多種糖類產生大量細菌素及表面活性劑來抑制致病菌，通過產生乳酸及過氧化氫等物質調整陰道內環境。當陰道內感染致病菌，并迅速增殖，出現菌群失調，此時乳酸桿菌減少或不變，喪失優勢地位，單一抑制細菌而不糾正陰道菌群失衡狀態，治療后陰道仍然處于易感狀態，這是陰道炎癥復發的主要原因。

蛇床子為傘形科植物，取成熟的果實，干燥后入藥，對心血管系統，免疫系統和神經系統等都有優異的保護作用。胡玉紅、張燕等[1]研究表明：蛇床子中酚類物質、單菇醇等物質對陰道菌群有抑菌作用，其有效成分主要來自蛇床子揮發油。毛櫻逾等[2]研究表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產酸能力，甚至提高乳酸桿菌的產酸能力。蛇床子有止癢作用，能有效緩解頑固性外陰瘙癢,有顯著的治療效果[3]。由于陰道微生態中多種微生物共存，乳酸桿菌與金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌等微生物相互抑制、相互依存，因此，在菌群失調模型的治療中，療效單一的藥物很難達到治療目的。因此，本實驗主要探究蛇床子提取物在拮抗陰道中致病菌：金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的作用，以及對乳酸桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種和材料

菌種：大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌，以及乳酸桿菌菌種均由佳木斯大學附屬第一醫院檢驗科微生物中心提供。蛇床子：購自佳木斯中醫院藥店。培養基：MRS選擇性培養基，血瓊脂平板、大腸桿菌顯色培養基、沙氏培養基等購自環凱微生物公司。

1.2 實驗對象

昆明小鼠160只，雌性、體重范圍在(15±2)g，購自哈爾濱醫科大學動物中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物提取和菌種活化

蛇床子提取物的制備：蛇床子50g，粉碎,過20目篩,用75%體積分數的乙醇溶液浸泡后進行超聲提取，每次1h，間隔分為3次進行，置于4℃，調整到8000rpm，離心10min，紗布過濾,所得濾液回收乙醇,并濃縮至50mL,即得1g/mL質量濃度的藥液，分裝備用[4]

將四種實驗菌種分別轉種活化、接種到各自增菌培養基，37℃下培養24～48h，其中乳酸桿菌置于厭氧罐中培養，用滅菌環形接種環挑取培養基表面的單個菌落，導入盛有生理鹽水的試管中攪拌、充分震蕩，分別制成0.5麥氏濁度混懸液[5]。

1.3.2 體外探究蛇床子提取物的MIC值

取96孔細菌培養板，標記分組。A、B、C、D四排分別標記為乳酸桿菌組、大腸桿菌組、白色念珠菌組和金黃色葡萄球菌組。從左至右依次編號為：1～10號。A、B、C、D組1號孔加入小牛血清150μL，2～10號孔均加入小牛血清100μL，A、B、C、D組1號孔加入蛇床子提取物藥液50μL，采用倍比稀釋法將1號孔的藥物2倍稀釋直至第8孔，每組1～9孔定量加入對應0.5麥氏濁度的菌懸液100μL，最終1～9號孔對應的藥物濃度分別為：125.00g/L，62.50g/L，31.25g/L，15.63g/L，7.81g/L，3.91g/L，1.95g/L；0.98g/L ，9號孔為陽性對照孔，10號孔為空白對照孔。恒溫 37℃，培養 24～48h，置于實驗臺，觀察以無菌生長孔所對應的蛇床子提取物質量濃度為最低抑菌濃度 (MIC值)，見表1。選取三種致病菌中最高的MIC值：7.81g/L，為第二階段動物實驗中藥物的有效藥物濃度。

1.3.3 蛇床子提取物對小鼠陰道菌群的影響

創建小鼠陰道菌群失調模型：隨機將160只小鼠分為四組：1號乳酸桿菌組、2號大腸桿菌組、3號白色念珠菌組和4號金黃色葡萄球菌組，每組40只。實驗1～4號組，每組全部小鼠陰道內均注入20μL該組對應的菌懸液，連續5d。第7天采集1～4組陰道沖洗液，稀釋后分別接種到對應培養基，1號組置于厭氧袋中，37℃培養48h后菌落計數，連續檢測2d。從實驗第9天起，將已建成的陰道菌群失調模型1～4號組內再隨機分成兩組：對照組及治療組，每組20只。對照組每日用60μL生理鹽水沖洗陰道；治療組用60μL，質量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液沖洗陰道，連續10d。療程結束后48h依照以上方法檢測各組小鼠陰道內實驗菌的菌落數，連續檢測2d。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

本實驗測得蛇床子提取物對大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為3.91g/L、7.81g/L和3.91g/L。取三者最高MIC值，即質量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液，進行小鼠菌群失調模型的治療。應用蛇床子治療前，1～4號組各組內對照組及實驗組陰道菌落數對比(P>0.05)差別無統計學意義，證明各組菌群失調模型間感染嚴重程度無差異。1號組中實驗組乳酸桿菌治療前、后差距無統計學意義(P>0.05)，對照組治療前、后無明顯變化，差距無統計學意義(P>0.05)，見表2；2號組中實驗組大腸桿菌治療后較治療前明顯下降，差距有統計學意義(P<0.05)，對照組治療后較治療前無明顯變化，差距無統計學意義(P>0.05)，見表3；3號組中白色念珠菌實驗組治療后較治療前明顯下降，差距有統計學意義(P<0.05)，對照組治療前、后無明顯變化，差距無統計學意義(P>0.05), 見表4；4號組中實驗組金黃色葡萄球菌治療后較治療前相比明顯降低，差距有統計學意義(P<0.05)，對照組治療前、后相比無明顯變化，差距無統計學意義(P>0.05),見表5。

表1 蛇床子提取物對4種實驗菌種的影響(n=20)

表2 乳酸桿菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數變化

表3 大腸桿菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數變化

表4 白色念珠菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數變化

表5 金黃色葡萄球菌組中對照組和實驗組給藥 前、后菌落數變化

3 討論

本實驗方法簡便、經濟可行，明確了蛇床子提取物對小鼠陰道3種常見致病菌的抑菌活性并測得各致病菌的MIC值。為動物實驗提供理論支持，選取3種致病菌的最高MIC值作為治療菌群失調模型的最適藥物濃度，起到預實驗效果，避免直接動物陰道內注入不同濃度梯度的藥液，出現藥物濃度過高對小鼠陰道壁細胞的損傷，影響實驗結論。乳酸桿菌在本實驗最高藥物濃度，即125g/L的藥液中仍能繼續生長，且相關文獻表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產酸能力甚至有增強作用。因此蛇床子提取物對乳酸桿菌的促進作用顯而易見，綜合馮鋒, 楊建宏等[6]研究表明蛇床子提取物有止癢作用，能顯著提高磷酸組織胺致癢閾，且對解脲支原體的最低抑菌濃度為 62.5～125μg/mL，與本實驗所得MIC值相符。楊小進，張華菲等[7]研究表明： 乳酸桿菌對本實驗3種受試菌有顯著抑菌作用。提高乳酸桿菌的優勢地位，分解糖原產生乳酸及抑菌物質，或通過生物奪氧方式、黏附機制和競爭排斥作用抑制致病菌的繁殖，具有良好的抑菌作用[8]。綜合以上說明蛇床子對于陰道炎癥的治療具有增加乳酸桿菌數目、提高乳酸桿菌產酸及抑菌能力、抑制解脲支原體、止癢等多重功效。對提高陰道炎臨床遠期療效，實現單一藥物，多效、低毒、抑菌合并重建陰道微生態有臨床意義。