葛根素聯合唑來膦酸對維甲酸誘導骨質疏松大鼠的治療作用①

徐 鵬，唐華羽

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

絕經后骨質疏松癥( postmenopausalosteoporosis，PMOP)，是60歲及以上女性人群的常見病，屬于骨骼代謝病。由于中年女性年紀增加導致其卵巢功能衰竭，繼而引發雌性激素分泌水平下降，從而打破成骨細胞以及破骨細胞之間的平衡，引發骨形成小于骨吸收。具體表現為骨量的下降與骨組織的顯微結構退行性變為特征[1]。在維甲酸誘導的大鼠骨質疏松模型中，維甲酸可引起生殖系統的嚴重損傷，造成大鼠體內雌激素水平下降導致大鼠高轉換型骨質疏松。即增加成骨細胞的活性與數量，相應的增加破骨細胞的活性，但對促進破骨細胞的數目與活性的作用要遠大于成骨細胞，這與人類PMOP具有良好的相似性[2，3]。由于體內雌激素水平下降，引起骨質疏松的同時并對生殖系統造成了相應的損傷[4]，因此激素替代治療成了首選，但通過傳統的雌激素療法，將會引發乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢增生等嚴重問題，存在相應的危險性[5]，因此使用植物性雌激素替代傳統的雌激素治療PMOP得到了專家們的重視，成為目前的研究熱點之一。

因此，本研究在唑來膦酸治療骨質疏松的基礎之上使用葛根素，觀察是否存在加強治療效果的作用。為臨床上治療絕經后的骨質疏松患者，提供可供參考的治療方案及實驗數據。

1.1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取40只健康雌性SD大鼠(SPF級，由佳木斯大學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK-(遼)2015-0001)12周齡，體重180～220g。室內飼養:溫度20～25℃、相對濕度40%～70%、每日光照12h、通風良好。

1.1.2 主要試劑：維甲酸(含量99.4%)，購于北京建強偉業科技有限公司。葛根素(含量98%)及唑來膦酸，均購于北京鼎國昌盛生物技術公司。

1.1.3 主要實驗儀器：Micro-CT(美國GE公司)、全自動生化分析儀(上海維鏑生物科技公司)、低溫離心機(中佳公司)、病理切片機(上海徠卡儀器公司)、正置光學顯微鏡(日本尼康)、包埋機(武漢俊杰電子公司)。

1.2 實驗動物分組與給藥

將40只雌性SD大鼠隨機分別為空白組、模型組、唑來膦酸組、聯合組，每組10只。將各組大鼠分籠飼養，自由飲水、攝食。適應性飼養1W后開始建模。造模時，除空白組外其余各組每日給予維甲酸100mg/(kg·d)進行灌胃，空白組每日給予維甲酸等量的蒸餾水進行灌胃，建模14d后，各組根據實驗設計進行給藥，唑來膦酸組與聯合組給予7mg/kg的劑量各注射一次，其余各組給予等量的生理鹽水進行注射。其中，聯合組每日給與葛根素50mg/(kg·d)進行灌胃，其余各組給予等量的蒸餾水進行灌胃，連續給藥10周。

1.3 組織樣品采樣與指標測定

1.3.1 血清樣品采集：給藥結束后，大鼠每只眼眶靜脈采集5mL血液，離心，取上清置于冰箱凍存，已備后用。

1.3.2 骨骼組織指數測定：栓塞法處死大鼠后用手術剪從大鼠腹部正中剪開，迅速找到大鼠股骨，剔除周圍肌肉韌帶組織后，PBS沖洗2次，用無塵無菌紙將PBS吸干，采用Micro-CT掃描股骨遠端生長板下方4mm為感興趣區掃描，檢測出股骨骨小梁的微結構(骨組織體積比、骨小梁厚度、骨小梁分離度、骨小梁數)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 股骨端骨顯微參數

實驗結果顯示，治療10周后的大鼠股骨遠端Micro-CT掃描結果如圖1所示。與空白組進行比較，模型組大鼠股骨的骨組織形態計量參數發生了顯著的改變。骨體積分數 (BV/TV) 、骨小梁數量 (Tb.N) 和骨小梁厚度 (Tb.Th) 顯著降低(P<0.01)，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著增加(P<0.01)，與唑來膦酸組與聯合組相比均具有統計學意義(P<0.05)。聯合給藥組股骨BV/TV、Tb.Th及Tb.N大于唑來膦酸組(P<0.05)。骨組織形態計量學參數顯示，葛根素與唑來膦酸能夠恢復骨質疏松大鼠股骨骨小梁的厚度，表明葛根素對骨再生具有協同作用。

Sham組 模型組 唑來組 聯合組

sham組 模型組型 唑來組 聯合組

圖1 各組骨微結構的改變(Pa<0.05,與sham組比較；Pb<0.05，與模型組比較；PC<0.05與唑來膦酸組比較)

圖2 S-Ca與S-P的變化(Pa<0.05,與sham組比較；Pb<0.05，與模型組比較；PC<0.05與唑來膦酸組比較)

2.2 血清鈣、磷水平

結果與空白組進行對比后發現，模型組S-Ca與的S-P水平顯著升高(P<0.05)，經葛根素、唑來膦酸治療后，S-Ca，S-P均降低，聯合治療組S-P低于單獨給藥組(P<0.05)，而S-Ca無顯著意義(P>0.05)。聯合治療組血清鈣、磷的含量與空白組相似，(P>0.05)見圖2。上述結果表明葛根素對大鼠骨質疏松血鈣、血磷具有協同作用。

2.3 各組股骨頭鏡下組織結構比較

空白組股骨頭周圍骨皮質厚而密，骨髓腔大小適中，骨皮質小梁結構粗大、致密并且排列整齊，骨髓腔中脂肪細胞數量較少，骨細胞形態正常，骨陷窩壁與骨細胞貼合緊密，沒有間隙。模型組組織整體結構較其他3組異常改變，骨髓腔中可見大量脂肪細胞增生，骨小梁數目明顯減少，各類原始細胞數量明顯減少，明顯呈骨質疏松表現；與模型組比較，唑來膦酸組組織整體結構輕度異常，骨髓腔中脂肪細胞數量較模型組有所減少，各類原始細胞數量增多。聯合組股骨頭周邊骨皮質較厚與骨小梁均勻平排列，小梁之間間隙變小，骨細胞與骨陷窩之間沒有明顯的間隙。骨質疏松病理現象明顯改善。見圖3。

圖3 各組股骨組織結構(HE染色×100 黑色箭頭所示脂肪細胞，紅色箭頭所示骨小梁)

3 討論

根據實驗研究發現，對照組大鼠骨切片整體結構異常，骨髓腔中骨小梁的數量明顯減少，大量脂肪細胞增生；各類原始細胞數量減少，并呈現骨質疏松的典型表現，說明研究模型制作成功。PMOP是一種骨質中減少有機成分，碳酸鈣及磷酸鈣下降，骨微結構受損，從而導致骨強度下降，骨脆性增大，易于發生骨折的骨骼性疾病，是最常見的代謝骨病之一[6]。2016年我國老年骨質疏松患病率達到36%，其中老年女性達到49%，表明代謝性骨質疏松在本國發病率明顯上升[7]。在臨床治療上，對于代謝性骨病往往以孕激素、雌二醇來治療代謝性骨質疏松，通過提高體內的雌激素水平，從而刺激成骨細胞的活性，糾正骨代謝異常[8,9]，逐步緩解生殖系統萎縮。但長期使用化學類激素，易引起心血管內壁的損傷及生殖系統癌變等嚴重問題，具有一定的風險性[2,10]。

本實驗中，應用Micro-CT是一種對骨組織微結構數值及骨密度測量的新型技術，多用于PMOP的測定及抗骨質疏松藥物的評價。本次實驗探究唑來膦酸、葛根素兩種藥物。葛根素具有雌激素的作用，是一種異黃酮類化合物，其能有效促進成骨細胞的生成，對骨質疏松大鼠起到骨保護作用。唑來膦酸療效確切，能夠明顯的抑制骨吸收的功能，能夠抵抗破骨細胞所產生的降解骨無機鹽的作用，藥物副作用小，由于與骨礦鹽結合能力強，導致藥物半衰期長，臨床患者治療只需1年注射1次，這樣大大地解決了患者的用藥順從性問題[11]。因此，唑來膦酸在臨床上被應用廣泛。本研究結果顯示，唑來膦酸聯合葛根素的實驗模型骨結構參數及血磷，與單獨應用唑來膦酸相比具有統計學意義(P<0.05)，表明葛根素可以發揮類雌激素的作用，在唑來膦酸診治骨質疏松的基礎之上，能夠加強治療效果。

綜上所述，葛根素與唑來膦酸，對于維甲酸誘導的骨質疏松模型體內的骨形成具有協同作用。葛根素聯合唑來膦酸可以是治療及預防骨質疏松的有效方案，為臨床用藥提供實驗依據。