姜黃素對高氧誘導的新生小鼠視網膜病變及notch 通路的影響

張艷莉，張彤

早產兒視網膜病變 （retinopathy of prematurity，ROP）又稱晶狀體后纖維增生癥，臨床上表現為新生血管生成、視網膜缺血、增生性視網膜病變，病情嚴重者可導致失明，隨著近幾年早產兒生存率增加，ROP 發病率也隨之增加，多發于低體重早產兒[1-2]。目前認為視網膜血管發育異常是ROP 的主要病因，因此緩解或阻止視網膜血管異常發育是當前治療ROP 的熱點[3]。姜黃素（Curcumin）是姜黃的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調節機體免疫功能、調節血脂等藥理作用[4-5]。最近研究表明，姜黃素可下調血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）表達水平，抑制血管生成和保護視網膜再灌注損傷[6-7]。Notch 信號通路作為生物體進化過程中高度保守的信號通路，可調控下游基因介導細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤生成、胚胎發育等生理病理過程，幾乎涉及機體所有組織和器官[8]。最近研究發現notch 信號通路可調控下游因子影響微血管穩定性和血管生成[9]。姜黃素在ROP 中的應用及如何調節notch 信號通路未見相關報道，因此本研究構建高濃度氧（高氧）誘導的C57BL/6J 幼鼠視網膜病變（oxygen induced retinopathy，OIR）模型作為研究對象，檢測不同濃度姜黃素處理后OIR 病癥緩解情況，初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2～3 周齡新生SPF 級C57BL/6J 健康幼鼠96只，購自成都達碩科技生物有限公司，許可證號：SCXK（川）2018-020，雌雄各半，未斷奶與哺乳母鼠共同飼養。動物房溫度設置為（25±1）℃，濕度（60±10）%，安靜無噪音，以12 h 為周期日光燈照明，實驗動物均自由攝食、哺乳、飲水。

1.2 試劑與儀器

姜黃素（S31628，＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司；阿帕替尼（MB3158，＞98%）購自大連美侖生物技術有限公司；偶氮藍（EvanS 藍）（A865881，98%）上海麥克林生化科技有限公司；兔抗鼠notch、兔抗鼠VEGF、兔抗鼠內參β-Actin、羊抗兔二抗購自美國Bioworld 公司；YKY-1200 型倒置二激發熒光顯微鏡購自上海永科光學儀器有限公司；Bio-Rad伯樂凝膠成像系統SYSTEM GelDoc XR+（1708195）購自美國BIO-RAD 公司。

1.3 實驗分組及造模

實驗分組：（1）對照組（CG）,灌胃給藥0.2 mL 雙蒸水；（2）高氧模型組（HOG）；（3）低劑量姜黃素組（LCG），劑量為20 mg/kg；（4）中劑量姜黃素組（MCG），劑量為50 mg/kg；（5） 高劑量姜黃素組（HCG），劑量為100 mg/kg；（6）阿帕替尼組（APG），劑量為30 mg/kg[10]。每組16 只，各組幼鼠體重、雌雄差異無統計意義（P＞0.05），姜黃素用雙蒸水配制，灌胃給藥，給藥體積均為0.2 mL，每日1 次，給藥治療1 周[11]。

除對照組外，其余幼鼠建立高氧誘導模型：將出生1 周后的C57BL/6J 幼鼠與哺乳期母鼠在氧倉內共同飼養，以1.5 L/min 的流量向氧倉通入100%濕潤醫用氧氣，控制氧氣濃度在（75±2）%。在造模期間，每隔4 h 檢測氧倉的濃度，以確保高氧環境，每天更換高氧環境中的哺乳期母鼠，同時觀察幼鼠的生理活動情況，其余飼養方式按照常規方式進行，幼鼠在高氧環境中飼養5 d 后，回歸正常飼養環境，鼠齡為第17 d 時，采用眼底檢查法，檢查前30 min 先用復方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，使用開瞼器將眼瞼分開，用前置鏡進行眼底檢查，確認模型均構建成功。檢查2 h 后方可進食，并按照分組給藥。

1.4 視網膜組織HE 染色

各組隨機選取8 只C57BL/6J 幼鼠脫頸處死，立刻摘取眼球，右眼球用于HE 染色；左眼球剝離視網膜組織，用于測定notch、VEGF 蛋白表達情況。

各組幼鼠右眼均在4℃條件下用4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，將石蠟包埋的切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續切片 （約6 μm），HE染色，每組隨機選取6 張切片，烘箱烘干，二甲苯脫臘10 min，將脫蠟后的切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水洗脫，然后脫水。蘇木素染色（5 min），鹽酸乙醇分化（30 s），50℃溫水浸泡5 min，然后脫水。伊紅染色（2 min），脫水、透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 視網膜內皮細胞核計數

將石蠟包埋的切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續切片（約6 μm），二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫行抗原修復，PBS 清洗3 次，置于3%過氧化氫溶液中，PBS 清洗3 次，3%BSA 覆蓋切片，滴加兔抗鼠VEGF（特異性標記內皮細胞）一抗，孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色至棕黃色，蘇木素復染，乙醇（含1%鹽酸）分化，0.6%氨水反藍，乙醇脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察結果，每組取8 張切片，使用雙盲法統計每只眼球每張切片突破內界膜的內皮細胞核數。注：（1）切片選取需避免視乳頭處；（2）僅計數與內界膜有聯系的血管內皮細胞核。

1.6 偶氮藍灌注血管造影法視網膜鋪片

各組隨機選取8 只C57BL/6J 幼鼠，1%戊巴比妥鈉0.06 mL/g 腹腔麻醉后，將其固定在簡易手術臺上，沿前肢與下領連線的中點，打開皮膚，分離一側頸動脈用，用無菌注射器抽取偶氮藍液體，針頭沿固定后的頸總動脈血管走行刺入約3 mm，當幼鼠嘴唇變藍后，取出針頭，夾閉頸總動脈，脫頸處死幼鼠，立刻摘取眼球。使用多聚甲醛（4%）固定0.5 h 后取出，在顯微鏡下觀察，用虹膜剪沿角鞏膜緣剪開，去除晶體、玻璃體及角膜，沿角鞏膜邊緣將鞏膜壁剪一缺口（操作過程中勿碰觸視網膜），將視網膜剝離，剪成花瓣狀，平鋪于無菌的載玻片上，封片，避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 各組視網膜notch、VEGF 蛋白表達水平測定

采用蛋白印跡法（western blotting，WB），將1.3中左眼視網膜組織加入含有蛋白酶抑制劑的200 μL裂解液，研磨至無組織碎塊，離心取上清。嚴格按照BCA 試劑盒說明書測定樣品總蛋白含量。加入樣品1/4 體積的5×上樣緩沖液，加熱至100℃，保持5 min。調整穩壓電源至100 V，穩壓電泳，當樣品進入分離膠后，增大電壓至120 V，當上樣緩沖液到達分離膠底部時，濕法轉膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉結合位點1 h。加入兔抗鼠notch（1:1000）、兔抗鼠VEGF（1:1000）、兔抗鼠內參β-Actin（1:1000），4℃孵育過夜，用PBS 清洗3 次，加入羊抗兔二抗（1:1000），25℃孵育，PBS 清洗3 次，顯色劑顯色、曝光、凝膠成像設備觀察。

1.8 統計學方法

使用SPSS22.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）形式表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數相比行SNK-q 檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高氧誘導的新生幼鼠視網膜病模型的驗證

正常環境飼養的C57BL/6J 幼鼠視網膜大血管管徑粗，分支清晰呈放射狀均勻分布，高氧誘導后，C57BL/6J 幼鼠視網膜毛細血管出現內皮增殖小結，血管呈小球狀，可見小出血及水腫，虹膜周邊有粘連，提示高氧誘導的新生幼鼠視網膜病模型構建成功（圖1）。

圖1 對照組和高氧模型組幼鼠眼底圖。1A 對照組（CG）；1B 高氧模型組（HOG），箭頭示血管呈小球狀，可見小出血及水腫

2.2 高氧誘導的新生幼鼠視網膜組織HE 染色

對照組視網膜內界膜結構均一，未見有明顯的血管內皮細胞突破內界膜。HOG組視網膜內界膜結構不完整，有大量血管內皮細胞突破內界膜。姜黃素給藥后，隨劑量增加，視網膜內界膜結構逐步恢復完整，突破內界膜的血管內皮細胞數逐漸減少，HCG組OIR 癥狀明顯得到改善，緩解程度與APG組相當（圖2）。

2.3 高氧誘導的新生幼鼠視網膜內皮細胞核計數

突破視網膜界膜血管內皮細胞數： 與CG組（1.20±0.26）個相比，HOG組（21.16±1.23）個，顯著增加（q=81.42，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組（14.49±0.53）個、MCG組（10.14±0.62）個、HCG組（7.45±0.42）個依次減少（q=27.21、44.95、55.93，P 均=0.000）。APG組（7.09±0.68）個與HOG組相比顯著減少（q=57.39，P=0.000），與HCG組相比差異無統計學意義（q=1.469，P=0.902）（圖3）。

圖2 高氧誘導的新生小鼠視網膜組織HE 染色（×200）。2A 對照組；2B 高氧模型組；2C 低劑量姜黃素組；2D 中劑量姜黃素組；2E 高劑量姜黃素組；2F 阿帕替尼組

圖3 視網膜組織VEGF 免疫組化染色（×100）。3A 對照組；3B 高氧模型組；3C 低劑量姜黃素組；3D 中劑量姜黃素組；3E 高劑量姜黃素組；3F 阿帕替尼組

2.4 偶氮藍灌注血管造影法視網膜鋪片

對照組可見視網膜血管自視盤發出的大血管向四周呈放射狀均勻分布，血管基本成熟，管徑粗，分支好，周邊血管網狀結構清洗，管徑粗，分支好，走行規整。HOG 型組大血管明顯變細，分支減少，行走紊亂，視網膜遠周及中央可見無灌注取，周邊血管密度增加，可見大量滲漏點，血管喪失放射狀結構。姜黃素給藥后，隨劑量增加，視網膜大血管逐漸變粗，血管行走逐漸規整，分支增多，周邊網膜清晰，HCG組OIR 癥狀明顯得到改善，緩解程度與APG組相當（圖4）。

2.5 高氧誘導的新生幼鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達水平

notch 蛋白表達:與對照組相比，HOG組notch蛋白表達水平顯著升高（q=28.01，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組、MCG組、HCG組notch 蛋白表達水平依次下降 （qLCG=10.57，qMCG=17.69，qHCG=22.36，均P=0.000）。APG組notch 蛋白表達水平與HOG組相比顯著下降（q=22.61，P=0.000），與HCG 相比差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5 和表1）。

VEGF 蛋白表達:與對照組相比，HOG組VEGF蛋白表達水平顯著升高（q=25.68，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組、MCG組、HCG組VEGF 蛋 白表達水平依次下降（qLCG=5.49，P=0.005；qMCG=14.27，P=0.000；qHCG=18.88，P=0.000）。APG組VEGF 蛋白表達水平與HOG組相比顯著下降 （q=19.10，P=0.000），與HCG組相比差異無統計學意義 （P＞0.05）（圖5，表1）。

圖4 偶氮藍灌注血管造影法視網膜鋪片。4A 對照組；4B 高氧模型組；4C 低劑量姜黃素組；4D 中劑量姜黃素組；4E 高劑量姜黃素組；4F 阿帕替尼組

圖5 高氧誘導的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達水平。A 對照組；B 高氧模型組；C 低劑量姜黃素組；D 中劑量姜黃素組；E 高劑量姜黃素組；F 阿帕替尼組

表1 高氧誘導的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達水平（，n=8）

表1 高氧誘導的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達水平（，n=8）

注：a 與HOG組相比，P＜0.05；b 與LCG組相比，P＜0.05；c 與MCG組相比，P＜0.05

3 討論

目前ROP 已成為早產兒失明的主要原因，占世界上兒童致盲病因的5%～20%[12]。ROP 發病機制分為高氧條件下血管關閉、消失和相對缺氧條件下血管異常增長。本研究選擇近交系的C57BL/6J 幼鼠，根據Smith 等[13]建立的方法構建高氧誘導的新生小鼠視網膜病變模型。本研究采用眼底檢查法證明高氧誘導的C57BL/6J 新生小鼠OIR 模型構建成功，與對照相比，高氧模型組視網膜內界膜結構不完整，有大量血管內皮細胞突破內界膜，突破視網膜界膜血管內皮細胞數顯著增加，大血管明顯變細，分支減少，行走紊亂，視網膜周邊及中央可見無灌注區，周邊血管密度增加，可見大量滲漏點，血管喪失放射狀結構，說明高氧模型組新血管增生、形態異常，未形成正常的血管屏障，提示本研究成功構建高氧誘導C57BL/6J 幼鼠視網膜病變模型。

姜黃素以藥理作用廣，副作用小成為目前研究的熱點之一[14]。研究發現，姜黃素能夠上調視網膜神經細胞中Thy-1 表達水平，以緩解急性高眼壓家兔視網膜神經細胞損傷，提示姜黃素可能對視網膜具有一定的保護作用[15]。何瓊等[16]發現姜黃素治療糖尿病大鼠后視網膜病變較輕，Ets-1 表達水平下調，提示姜黃素可能抑制Ets-1 表達水平，從而緩解糖尿病視網膜病變癥狀。隨后研究也證實姜黃素改善糖尿病引起的視網膜變薄、神經節細胞、內核層細胞凋亡、毛細血管基底膜增厚和光感受器細胞膜紊亂等癥狀[17]。本研究發現，與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素后，OIR 幼鼠視網膜內界膜結構逐步恢復完整，突破內界膜的血管內皮細胞數減少，視網膜大血管變粗，血管行走規整，分支增多，周邊網膜清晰，呈劑量依賴性，且高劑量姜黃素與阿帕替尼藥效相近，說明經治療后，OIR 幼鼠視網膜病變癥狀得到緩解，血管生長趨向正常，提示姜黃素能夠緩解OIR 幼鼠視網膜病變癥狀，有望成為治療ROP 的備選藥物。

隨著新生兒血管發病機制的進一步研究，早產兒視網膜血管發育不完整，導致視網膜缺血，進一步引起新生血管形成且伴有纖維化，致使視網膜病變、脫離，因此從血管生成抑制方面研究如何預防或治療ROP 意義深遠。VEGF 在糖尿病視網膜患者血清中高表達，說明VEGF 與血管內皮功能、微血管損傷相關[18]。黃黎黎等[19]研究表明拮抗VEGF 治療能夠改善視網膜微血管功能和黃斑水腫，增強激光療效。本研究發現，與對照組相比，高氧模型組視網膜組織中VEGF 表達水平顯著升高，提示幼鼠OIR 進程中VEGF 高表達。與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素組視網膜組織中VEGF 蛋白表達水平顯著下降，呈劑量依賴性，且高劑量姜黃素與阿帕替尼作用一致，提示姜黃素可抑制OIR 幼鼠視網膜組織中VEGF 表達，從而緩解幼鼠OIR 癥狀，但是姜黃素通過何種通路下調VEGF 表達水平還有待進一步研究。研究發現姜黃素可能通過阻斷Notch 信號通路，抑制NF-kB 的表達，下調腫瘤組織中VEGF 表達水平，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[20]。賀桂芳等[21]研究表明姜黃素PDT 可有效阻斷Notch 信號通路，抑制宮頸癌細胞增殖。本研究表明，與對照組相比，高氧模型組視網膜組織中notch 表達水平顯著升高，提示notch 信號通路可能參與幼鼠OIR。進一步分析發現，與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素組、阿帕替尼組視網膜組織中notch 表達水平顯著下降，呈劑量依賴性，高劑量姜黃素組與阿帕替尼組相比無差異，提示姜黃素能夠下調notch 表達水平，可能通過阻斷notch 信號通路而緩解幼鼠OIR 癥狀。

綜上所述，姜黃素可能通過阻斷notch 信號通路，抑制VEGF 表達，減少血管異常增生，進而緩解幼鼠OIR 癥狀，推測姜黃素有望成為臨床上治療ROP 的備選藥。但由于本研究小鼠模型實驗樣本量小，且不能完全代表早產兒ROP 的發病過程，該研究結果需要進一步擴大樣本量和從細胞水平研究加以驗證。